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流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae),是一类外被囊膜,内含片段化负义RNA链的病毒。流感病毒分为A、B、C三型。A型和B型流感病毒是流感病毒中两大类能引起大规模疫情的病毒。它们共同含有三种在结构和功能都具有相似性的跨膜蛋白:HA/BHA、NA/BNA、M2/BM2。其中:M2/BM2为非糖基化的Ⅲ型跨膜整合蛋白,其结构分为三个部分,一个单次跨膜的α螺旋区,一个短的NH2端胞外区和一个较长的COOH端胞内区。M2/BM2的功能主要表现为其跨膜区以四聚体形式形成质子通道。通过平衡膜内外pH值,M2/BM2在病毒颗粒脱壳释放其内部遗传物质过程中发挥关键作用,以及在HA蛋白合成后的运输过程中保持其构象。此外,研究还发现M2/BM2的胞内区在病毒的复制和组装过程中也发挥重要作用,但迄今为止M2/BM2的胞内区如何行使功能以及它们之间在进化与功能上的相关性还不清楚。
本论文的研究目的是探索M2/BM2蛋白的胞内区的功能及其相互关系。研究主要是通过两个方面的工作来进行。一方面是研究M2/BM2与宿主因子的相互作用,并探讨这种相互作用的功能意义；另一方面是对M2/BM2的胞内区进行分段突变,并检测这些突变对M2/BM2行为以及病毒复制的影响。首先我们通过酵母双杂交筛选到Na+/K+-ATPaseβ1亚基(ATP1B1)与BM2蛋白的胞内区相互作用,通过GST pull-down,免疫共沉淀和细胞内共定位等验证试验,我们确定了宿主ATP1B1与M2和BM2蛋白的胞内区发生相互作用以及ATP1B1与BM2各自的相互作用区域。通过建立稳定的ATP1B1基因表达抑制细胞系,我们发现在ATP1B1表达受到显著抑制后,M2/BM2的膜定位受到抑制,而流感病毒A/WSN/33在细胞中的复制也受到抑制。实验结果揭示出宿主蛋白ATP1B1可能通过和流感病毒M2/BM2蛋白细胞膜定位信号区的相互作用在流感病毒复制过程中发挥重要功能。此外,通过研究并结合相关文献,我们发现并证实M2/BM2胞内区不但参与病毒蛋白的组装,而且还与自身在细胞内的转运密切相关。通过对M2/BM2胞内区进行较为精细的区段缺失突变,并通过免疫荧光染色观察其突变后在细胞内定位,我们发现了M2/BM2的细胞膜定位的信号区段,该信号区可能通过与宿主蛋白ATP1B1相互作用,使得M2/BM2从高尔基体转运到细胞膜上,从而参与到流感病毒的组装。我们还发现在流感病毒的感染过程中,病毒和宿主蛋白的相互作用并非是单向的,而可能是形成一个相互影响的网络,例如在本研究中,ATP1B1可能在帮助M2/BM2从高尔基体到细胞膜的过程中发挥重要作用,而ATP1B1自身在病毒的感染中也发生糖基化和细胞内定位的变化,而这种变化则可能正是其与M2/BM2相互作用并发挥功能的前提之一。通过以上两方面的研究,我们发现了M2/BM2存在一个细胞膜定位的信号区,ATP1B1通过与该信号区的相互作用帮助M2/BM2向细胞膜上转运,从而在流感病毒的复制中发挥重要功能。
我们还发现M2和BM2蛋白各自的细胞膜定位信号区能够人为进行互换,以至将M2和BM2的整个胞内区进行互换也能实现相同的细胞膜定位功能。用BM2的细胞内区替换M2的细胞内区还能顺利拯救出包含嵌合M基因的A/WSN/33突变病毒,说明流感病毒M2/BM2整个细胞内区能实现功能上的互换。结果进一步表明M2和BM2存在进化上的亲缘关系。
流感病毒由于其频繁的突变,能不断逃逸宿主的免疫识别和攻击,也给针对其进行的疫苗和药物开发提出了严重挑战。例如针对M2的质子通道靶点的金刚烷胺等抗病毒药物就因为病毒越来越高的耐药性而逐渐失去抗病毒的效果。但因M2/BM2在流感病毒中是相对较保守的蛋白,仍可以作为很好的药物靶标,本论文通过研究M2/BM2与ATP1B1相互作用以及发现了M2/BM2细胞膜转运的信号区,通过M2和BM2膜转运信号区段互换和细胞质内段的互换,以及相关嵌合病毒的拯救,不但加深了我们对流感病毒M2和BM2功能与结构的理解,以及流感病毒和宿主相互关系的认识,而且也为抑制病毒增殖提供了理论上新的药物靶点,寻找到抗病毒的一个新的可能机会。