第一章卵巢癌多药耐药正选择位点的筛选目的:综合运用生物信息学方法,结合前期研究结果,筛选与卵巢癌多药耐药相关基因中的正选择位点。方法:本研究从生物信息学的角度,根据GenBank、Ensembl及UniProt数据库中所收载后生动物来源的30个(ABCA1、ABCB11、ABCC8、ABCC11、ABCD2、TAP1、COL4A2、CTNNB1、EGFR、FYN、IGF1R、ITGB4、LAMA2、LAMA4、MRLC2、PAK7、PARVA、PDGFC、PIK3R1、PPP1CA、PRKCA、PTK2、RAPGEF1、SHC4、TLN1、VAV2)与卵巢癌耐药相关基因的序列信息,利用目前已开发的正选择位点分析、分子进化分析、蛋白质结构及功能位点分析等软件工具,利用位点模型检测对这些基因进行适应性进化分析。并将正选择位点转换成DNA突变位点,同时对正选择基因进行磷酸化位点预测。选择其中正选择位点与磷酸化位点重合者运用Sequenom MassARRAY方法检测肿瘤组织突变。提取43例铂类敏感卵巢癌患者及50例铂类耐药卵巢癌患者的新鲜冰冻组织样本DNA行以上检测。结果:位点模型检测到共有13个基因(ABCA1、ABCB11、ABCC8、ABCC11、ABCD2、COL4A2、EGFR、IGF1R、ITGB4、LAMA2、PIK3R1、RAPGEF1、VAV2)受到正选择作用,各自有数量不等的正选择位点。其中正选择位点与预测的磷酸化位点重合的有ITGB4-rs368526254、RAPGEF1-rs41297229、RAPGEF1-rs202232900、VAV2-rs756680997四个。位点分型显示以上四个位点在卵巢癌患者中未发生突变。结论:ABCA1、ABCB11、ABCC8、ABCC11、ABCD2、COL4A2、EGFR、IGF1R、ITGB4、LAMA2、PIK3R1、RAPGEF1、VAV2基因在物种进化过程中受到正选择作用。其中有4个正选择位点与磷酸化预测位点重合,但在卵巢癌敏感及耐药患者中均未发生突变,与卵巢癌耐药无明显相关性。第二章正选择位点的临床样本验证目的:筛选与卵巢癌多药耐药相关的正选择位点,并分析其与卵巢癌耐药、临床特征、预后的关系。方法:将全部正选择氨基酸位点转换成DNA的突变位点,选取MAF>0.05且预测有功能的位点进行分型检测。提取199例卵巢癌组织蜡块及新鲜冰冻组织DNA,其中耐药组62例,敏感组137例,运用AgenaMassArray系统对位点进行基因分型。并分析其与耐药、临床病理、预后的关系。结果:(1)通过卡方检验比较两组病例在不同临床指标之间的分布情况,发现分期、手术满意程度(残瘤径)、淋巴结转移、腹腔转移在敏感和耐药组之间分布差异具有统计学意义(p<0.05)(2)通过二元logistic回归分析发现LAMA2的位点rs1027199与耐药相关,纯合子突变型比野生型降低发生耐药的几率(p=0.049,adjusted OR=0.343,95%CI:0.118-0.997)。校正后依然具有统计学上的显著性(p=0.035,adjusted OR=0.255,95%CI:0.072-0.908)。(3)二元logistic回归分析显示ABCC8的正选择位点rs757110与发病时的分期相关,杂合子突变型降低发病时的期别。(OR=0.280,95%CI0.097-0.809,P=0.019)(4)Kaplan-Meier方法显示FIGO分期、残瘤径、淋巴结转移和腹腔转移对PFS和OS有影响(p<0.05)。LAMA2的正选择位点rs3816665与预后相关,GA突变型较GG野生型明显降低PFS时间(突变型:均数17.874±3.452,95%CI11.109-24.640,野生型:均数65.066±6.690,95%CI51.953-78.179,P=0.049),亦明显降低总生存时间(突变型:均数32.101±6.270,95%CI19.813-44.390,野生型:均数76.054±11.864,95%CI52.801-99.308,P=0.014)。COX风险比例回归模型分析显示:残瘤径是影响卵巢癌患者PFS的独立影响因素。rs3816665基因型和残瘤径是影响卵巢癌患者OS的独立危险因素。结论:LAMA2的位点rs1027199与耐药相关,纯合子突变型比野生型降低发生耐药的几率。LAMA2的另一个正选择位点rs3816665与预后相关,突变型的OS明显低于野生型。ABCC8的正选择位点rs757110与发病时的分期相关,杂合子突变型降低发病时的期别。第三章受到正选择的基因在卵巢癌及耐药细胞中的生物功能研究目的:选择13个正选择基因中在卵巢癌亲本及耐药细胞中表达差异最大的基因进行生物功能研究。构建敲除及过表达慢病毒载体并进行鉴定,研究基因表达改变后细胞生物功能的改变。方法:(1)在SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、A2780/DDP细胞中提取m RNA,2ˉ-△△Ct法测定13个正选择基因的相对表达量。2)利用CRISP/Cas9技术构建ITGB4敲除及过表达卵巢癌细胞株,QRT-PCR、WB方法对转染效果进行鉴定。(3)CCK8法检测慢病毒转染后细胞的IC50及生长曲线。(4)流式细胞仪检测慢病毒转染后细胞在不同浓度顺铂的作用下细胞周期的变化。(5)transwell法检测慢病毒转染后细胞的迁移、侵袭能力。结果:(1)ITGB4在SKOV3/DDP、A2780/DDP耐药细胞中均较对应的亲本细胞相对表达量最高,其中在A2780/DDP细胞中尤为明显,相对表达量达37.27倍。(2)成功利用CRISP/Cas9方法构建ITGB4敲除及过表达卵巢癌细胞株,QRT-PCR结果显示ITGB4-sgRNA(02447-1)慢病毒敲除效率最高(相对阴性对照组干扰效率达99.4%),ITGB4-sgRNA(02458-1)慢病毒过表达效率最高(相对表达量相对阴性对照组达16.99062倍)。WB结果与QRT-PCR结果一致。(3)下调ITGB4基因的A2780/DDP细胞对顺铂的IC50明显下降(P<0.05),而空白对照组及阴性病毒组的差别不明显(P>0.05)。上调ITGB4基因的A2780细胞对顺铂的IC50明显增高(P<0.05),而空白对照组及阴性病毒组的差别不明显(P>0.05)。采用CCK8法检测六组细胞7天的生长曲线,结果显示下调ITGB4基因后的A2780/DDP细胞从第4天起细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),上调ITGB4基因的A2780细胞从第4天起细胞增殖能力明显增强(P<0.05)。(4)流式细胞仪检测细胞周期实验中,与未加DDP组相比,顺铂诱导各组细胞S期及G2期细胞增加,当DDP浓度达到1μg/ml时,ITGB4敲除株较两对照组细胞阻滞于S/G2期的细胞明显减少(P<0.05),ITGB4过表达株较两对照组细胞阻滞于S/G2期的细胞明显增多(P<0.05)。(5)transwell实验中,ITGB4敲除株较另两个对照组迁移和侵袭能力下降(P<0.05),ITGB4过表达株较另两个对照组迁移和侵袭能力增强(P<0.05)。结论:ITGB4下调减弱卵巢癌A2780/DDP细胞的耐药、增殖、迁移、侵袭能力,顺铂作用下ITGB4下调细胞株在S/G2期阻滞减少,顺铂敏感性增加。ITGB4上调增强卵巢癌A2780细胞的耐药、增殖、迁移、侵袭能力,顺铂作用下ITGB上调细胞株在S/G2期阻滞增加,顺铂敏感性降低。第四章ITGB4对卵巢癌A2780/DDP细胞多药耐药中自噬和凋亡的影响及机制研究目的:探讨ITGB4基因对卵巢癌细胞的耐药性影响是否与自噬和凋亡有关,以及通过哪条通路进行调节。方法:(1)4μg/ml顺铂分别处理24小时A2780/DDP扰码对照组细胞及ITGB4敲除组细胞,通过透射电镜观察两组细胞自噬小体的形成。(2)4μg/ml顺铂分别处理24小时A2780/DDP扰码对照组细胞及ITGB4敲除组细胞,通过激光共聚焦免疫荧光法观察两组细胞LC3蛋白的聚集分布情况。(3)4μg/ml顺铂分别处理24小时A2780/DDP扰码对照组细胞及ITGB4敲除组细胞,免疫印迹法检测两组细胞LC3-II及p62蛋白的表达。(4)4μg/ml顺铂分别处理24小时A2780、A2780-NC、A2780-ITGB4过表达细胞及A2780/DDP、A2780/DDP-NC、A2780/DDP-ITGB4敲除细胞,免疫印迹法检测各组细胞自噬及凋亡相关蛋白的表达量。结果:(1)经顺铂处理后,透射电镜可见A2780/DDP扰码对照组细胞有自噬小体形成,A2780/DDP-ITGB4敲除细胞无自噬小体形成。(2)经顺铂处理后,免疫荧光法可见对照组及实验组LC3蛋白均开始聚集成团,分布在细胞质中,其中,实验组LC3聚集的现象与对照组相比较弱。(3)经顺铂处理后,对照组及实验LC3-Ⅱ蛋白表达增多。其中加药后实验组细胞LC3-Ⅱ蛋白表达水平低于对照组(p<0.05),p62表达水平高于对照组(p<0.05),考虑实验组自噬程度可能较对照组弱。(4)4μg/ml顺铂分别处理后,与对照组相比,过表达组细胞中ERK1/2、AMPK、PTEN、AKT1、p-AKT1、p-AMPK、m TOR、p-mTOR的蛋白表达无明显变化(p>0.05),p53蛋白表达均数升高,但无统计学意义;ITGB4敲除组中,p53蛋白表达明显下调(p<0.05)。结论:ITGB4基因敲除后减少卵巢癌耐药细胞在顺铂诱导下的自噬发生,ITGB4可能通过自噬增强卵巢癌细胞的耐药性,并可能通过p53介导的自噬通路对自噬产生影响。