研究背景随着经济发展、生活水平提高及生活方式的改变,冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）的发病率逐年上升,且发病年龄存在年轻化趋势,CHD目前已经成为对人类有最大威胁的疾病之一。近10年来,我国居民CHD死亡率快速增加,2015年我国CHD死亡率为110.91/10万,预测在未来20年,我国居民CHD发病率及死亡人数会持续上升,将来有可能成为我国居民死亡的主要原因^[1]。随着经皮冠状动脉内血管成形术（PTCA）及冠状动脉内支架植入术的出现及进一步发展,对于CHD的治疗已经开启了介入心脏病学的新时代。40年来,冠状动脉介入治疗（PCI）得到了飞速发展,从单纯的球囊扩张成形术,到冠脉支架植入术,从金属裸支架（BMS）到药物涂层支架（DES）及生物可吸收支架,目前支架技术已被广泛应用于各种冠脉不同程度狭窄的患者中,狭窄或闭塞的心脏血管被开通后,缺血的心肌得到再灌注,能够迅速改善缺血相关症状,并成功挽救了许多患者的生命,随着支架技术的进步,介入术后再狭窄的发生率逐渐下降,然而,即便是最新型的DES的出现也并未从根本上使冠状动脉支架内再狭窄（in-stent restenosis,ISR）问题得到最终解决,在PCI患者中ISR总的发病率仍达3%-20%^[2,3]。ISR依然是困扰临床介入医师的难题。所以,进一步研究再狭窄的机制并探寻治疗再狭窄的新方法,对于改善PCI术后患者的预后有极其重要的意义^[4]。ISR实质上就是血管内膜受到损伤后的一种愈合反应,它是多种生长因子及血管活性物质相互作用,而导致的非常复杂的生物学过程。损伤内皮的过度愈合及对血管重建术所致创伤的不良反应,最终导致血管再狭窄的发生^[5]。内皮细胞受到损伤是再狭窄发生的始动因素,损伤的内皮细胞与聚集状态的血小板共同分泌各种细胞因子,这些细胞因子作用于损伤部位的血管平滑肌细胞（VSMC）,导致VSMC过度增殖和移行,而VSMC的过度增殖和迁移被认为是导致新生内膜增厚、管腔狭窄的最主要的原因^[6]。新生内膜过度增生是再狭窄发生过程中非常重要的环节,而在导致新生内膜增生的原因中,除了VSMC过度的增殖和迁移,VSMC凋亡的不足也扮演重要的角色^[7,8]。血管内皮损伤后,在整个血管修复过程中都伴随着VSMC的凋亡,但相对于过度增殖的VSMC,凋亡显得相对不足,所以促进VSMC凋亡可以减少细胞数量,减轻再狭窄程度,因此目前认为促进VSMC凋亡是治疗PCI术后再狭窄的不容忽视的治疗措施。国内外大量研究均证实^[9-11],促进VSMC凋亡可减少受刺激后过度增殖的VSMC的数量,使内膜增生减轻,达到预防PCI术后ISR的目的。进一步研究并探寻促进VSMC凋亡的因素及作用机制能够降低术后ISR的发生率。虽然目前临床上已经有很多促进VSMC凋亡的方法及药物,然而寻找更加直接的作用靶点,以及安全、有效的药物仍非常重要。Rho是小分子G蛋白,属于Ras超家族,广泛分布于所有哺乳动物的组织细胞中,在细胞的信号转导通路中,可以作为分子开关或信号转换器,作用于相关的靶蛋白而产生多种生物学效应^[12]。Rho激酶（ROCK）作为Rho的主要下游效应分子,在细胞的分化、细胞周期进展、细胞增殖及凋亡中发挥着十分重要的作用^[13]。多种细胞均表达ROCK,对于不同的组织细胞,ROCK激活后可能产生不同的效应,目前研究表明,ROCK的过度激活、表达升高均可导致疾病,而ROCK活性不足、低表达,尚未发现可引起相关疾病^[14]。Rho/ROCK通路可以与多种血管活性物质互相作用,参与各种心血管疾病的发生发展^[15],我们前期的动物实验也已经证实:急性心肌梗死（AMI）、心力衰竭及心肌缺血/再灌注损伤时,心肌细胞中ROCK mRNA表达升高,而应用ROCK特异性抑制剂-fasudil后,可以降低ROCK mRNA的表达,保护缺血心肌,改善心功能。进一步研究发现,fasudil的心肌保护作用与其抑制ROCK,减少心肌细胞凋亡相关^[16-19]。近几年来,关于ROCK与ISR关系的研究非常引人注意,ROCK能够通过多种途径参与术后ISR的形成过程^[20,21]。目前已有学者尝试从Rho/ROCK通路上寻找防治ISR的新办法,Matsumoto等^[22]第一个报道了ROCK在ISR中所起的作用,他们通过在猪的冠状动脉内植入支架,观察Rho/ROCK在支架植入后血管再狭窄的作用,发现ROCK能够通过作用于VSMC收缩、内皮功能及炎症过程参与支架植入后血管内膜增生和再狭窄的调控过程。国内亦有相关研究,也均证实ROCK参与ISR的发生发展,其机制大多都集中在内皮损伤、炎症细胞浸润、VSMC迁移、增殖等方面^[23-25]。关于ROCK在调节VSMC凋亡方面的作用,目前研究较少,机制不明,且争论较大。我们前期的研究已经发现ROCK能够促进心肌细胞凋亡,但是,是否对所有的细胞都有促凋亡作用?是否对不同的细胞,甚至是同一细胞所处的状态不同,都会产生不同的作用?而其作用机制又是什么,能否与其调节细胞自噬相关?本研究通过观察血管内膜损伤后VSMC凋亡及ROCK mRNA的动态变化,进一步探讨ROCK与VSMC凋亡的关系及其参与再狭窄发生发展的机制。研究目的观察动脉内膜损伤后大鼠VSMC中ROCK mRNA表达的变化,及VSMC的凋亡情况,并观察ROCK抑制剂fasudil对血管内膜及中膜厚度的影响,分析ROCK信号通路与VSMC凋亡的关系及fasudil预防动脉损伤后再狭窄的作用及机制,并初步探讨ROCK与VSMC自噬的关系。研究方法1、建立动物模型及分组:选取雄性Wistar大鼠,自大鼠左颈总动脉插入自制的2F球囊导管,球囊损伤大鼠胸腹主动脉内膜;并随机分为:A.模型组（Model Group）B.治疗组（Treatment Group）及C.对照组（Control Group）,对照组仅分离并结扎左颈总动脉,不插入球囊导亦不损伤血管内膜。治疗组给予fasudil腹腔注射5 mg/kg,每日2次,共4周;模型组及对照组则给予等量生理盐水腹腔注射。2、HE染色观察血管内膜及中膜厚度的变化:动脉内膜损伤术后4周取大鼠主动脉组织,甲醛固定,石蜡包埋,制作石蜡切片,行HE染色,观察各组主动脉内膜及中膜平滑肌细胞增殖情况,及内膜及中膜厚度的变化,比较动脉内膜损伤后大鼠较对照组大鼠内膜及中膜增生程度及应用fasudil治疗后,内膜及中膜厚度的变化。3、免疫组化染色观察凋亡相关蛋白表达的变化:大鼠主动脉内膜损伤后4周,取主动脉血管,行免疫组化染色,观察各组大鼠主动脉内膜及中膜平滑肌细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达水平。比较动脉内膜损伤后大鼠较对照组大鼠VSMC中Bcl-2及Bax表达的变化及应用fasudil治疗后对凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达水平的影响。4、TUNEL染色观察VSMC凋亡数量:术后4周,取大鼠主动脉血管组织,观察并比较各组大鼠主动脉内膜及中膜VSMC凋亡数量的变化,计算其凋亡率及平均积分光密度（IOD）值,并观察应用fasudil治疗后对VSMC凋亡率及IOD值的影响。5、实时荧光定量PCR（Real Time-PCR）法检测ROCK mRNA的表达:术后4周,取大鼠主动脉血管组织,提取VSMC中RNA,观察各组VSMC中ROCK mRNA的表达水平。比较动脉内膜损伤后大鼠较对照组大鼠VSMC中ROCK mRNA表达的变化,及应用fasudil治疗后对VSMC中ROCK mRNA表达的影响。6、免疫印迹法（Western Blot）检测自噬相关蛋白的表达:术后4周,取大鼠主动脉血管组织,提取蛋白,观察各组大鼠VSMC中自噬相关蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ的表达,比较动脉内膜损伤后大鼠较对照组大鼠自噬相关蛋白表达的变化,及应用fasudil治疗后对Beclin-1及LC3-Ⅱ表达的影响。研究结果1、球囊动脉内膜损伤术后24小时存活的52只大鼠,其中模型组20只,治疗组20只,对照组12只,在随后4周的干预期内共死亡3只,其中模型组2只,治疗组1只,对照组无死亡,模型组及治疗组的死亡率分别为10%和5%,两组比较差异无显著性（P>0.05）。最后进入实验数据分析的大鼠为:模型组18只,治疗组19只,对照组12只。2、大鼠主动脉内膜球囊损伤后4周,内皮细胞基本爬满创面,平滑肌细胞大量增殖,导致血管内膜及中膜增厚,与对照组（内膜:21.8±2.93,中膜:194.3±9.09）相比,内膜损伤后大鼠血管内膜及中膜明显增厚,差异有显著性,P<0.05;与模型组（内膜:99.6±5.42,中膜:311.6±17.00）相比,治疗组（内膜:91.3±9.11,中膜:291.6±19.74）,在应用fasudil治疗后,血管内膜及中膜增生明显减轻,差异有统计学意义,P<0.05。3、大鼠动脉内膜损伤后,与对照组（0.43±0.041）相比,VSMC中ROCK mRNA表达明显升高;而治疗组（0.31±0.041）在应用fasudil 4周后,与模型组（0.51±0.036）相比,ROCK mRNA明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。4、与对照组（Bcl-2:0.93±0.08,Bax:0.82±0.54）相比,大鼠动脉内膜损伤后,凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax均升高,差异有统计学意义,P<0.05;应用fasudil治疗后,治疗组（Bcl-2:1.15±0.09,Bax:2.39±0.16）与模型组（Bcl-2:2.12±0.12,Bax:1.64±0.13）相比,Bcl-2表达降低,而Bax表达进一步升高,差异具有显著性,P<0.05。5、大鼠动脉内膜损伤后,TUNEL染色提示血管内膜及中膜VSMC凋亡数量明显增加。而应用fasudil治疗4周后,与模型组（内膜:凋亡率6.28±2.69,IOD 0.10±0.03;中膜:凋亡率7.32±2.41,IOD 0.11±0.04）相比,治疗组VSMC凋亡数量增加,凋亡率（内膜:9.64±2.76,中膜:10.51±2.71）及IOD值（内膜:0.13±0.04,中膜:0.14±0.04）均升高,统计学有显著性差异,P<0.05。6、与对照组（Beclin-1:9.80±2.09,LC3-Ⅱ:13.81±2.66）相比,大鼠动脉内膜损伤后,自噬相关蛋白Beclin-1及LC3-Ⅱ表达升高;而治疗组（Beclin-1:26.04±4.83,LC3-Ⅱ:33.00±4.46）应用fasudil治疗4周后,与模型组（Beclin-1:21.38±3.24,LC3-Ⅱ:25.59±3.61）相比,Beclin-1及LC3-Ⅱ表达进一步升高,差异有统计学意义,P<0.05。研究结论1、大鼠动脉内膜损伤后VSMC明显增殖,导致管腔狭窄,在VSMC增殖的同时伴有VSMC凋亡,但细胞凋亡的相对不足,最终导致血管狭窄的发生。2、大鼠动脉内膜损伤后,VSMC中ROCK mRNA表达明显升高,细胞增殖明显,而应用fasudil抑制ROCK mRNA后,VSMC凋亡明显增加,内膜及中膜厚度降低。说明fasudil能够通过促进VSMC凋亡来减少细胞数量,减轻内膜及中膜增生,降低血管狭窄程度。3、fasudil促进VSMC凋亡的作用,可能与其促进VSMC自噬相关。