论文部分内容阅读
研究背景与目的人类多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化O-聚糖合成的第一步反应,将UDP-GalNAc上的GalNAc基因转移至蛋白多肽链上特定序列中的Ser或Thr的羟基上,从而合成GalNAca-O-Ser/Thr多肽,初步研究提示该酶的异常表达可能与肿瘤的失控生长和恶性转移有关。ppGalNAc-T10是该家族中研究较少的成员,作为O-糖链合成的起始酶,很有可能是O-糖链合成的限速酶,有着重要的生物学意义。本文旨在探讨ppGalNAc-T10对人结直肠癌细胞LoVo增殖及浸润转移的影响。研究方法采用PCR方法合成含有酶切位点(XbaⅠ、EcoRI)的ppGalNAc-T10cDNA。构建pMD18T-ppGalNAcT10-ORF和pMD18T-ppGalNAcT10-antisense,鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列。双酶切目的载体pcDNA3.1后,与ppGalNAcT10-ORF和ppGalNAcT10-antisense片段进行连接,构建正义和反义真核表达载体pcDNA3.1-ppGalNAcT10-ORF(文中缩写为pcDNA-T10(+))和pcDNA3.1-ppGalN AcT10-antisense(文中缩写为pcDNA-T10(-)),将其分别转染293T细胞,Western blot法检测ppGalNAc-T10蛋白的表达。ppGalNAc-T10正义真核表达载体pcDNA-T10(+)、反义真核表达载体pcDNA-T10(-)与pcDNA空载体分别转染人结直肠癌细胞株LoVo细胞,Western blot检测ppGalNAc-T10蛋白表达水平的变化,确定转染效果。CCK8法检测转染后各实验组LoVo细胞增殖的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,穿膜实验检测细胞侵袭能力的变化。利用realtime RT-PCR和Western blot方法检测TGF-βⅠ和TGF-βRⅡ肿瘤浸润转移相关基因的表达变化。研究结果pcDNA3.1-ppGalNAcT10-ORF和pcDNA3.1-ppGalN AcT10-antisense包含大小、序列正确的ppGalNAc-T10片段；ppGalNAc-T10蛋白在转染pcDNA3.1-ppGalNAcT10-ORF的293T细胞中高表达,在转染pcDNA3.1-ppGalN AcT10-antisense的293T细胞中表达降低。Western blot证明各实验组LoVo细胞经转染不同ppGalNAc-T10载体后,ppGalNAc-T10蛋白表达量发生变化,转染ppGalNAc-T10正义真核表达载体的LoVo细胞,ppGalNAc-T10的蛋白表达量增加,此时细胞的增殖受到抑制,迁移能力和侵袭能力降低,TGF-βⅠ和TGF-βRⅡ基因在mRNA和蛋白质水平的表达增高；而转染ppGalNAc-T10反义真核表达载体的LoVo细胞,ppGalNAc-T10的蛋白表达量降低,细胞生长加快,迁移能力和侵袭能力增强, TGF-βⅠ和TGF-βRⅡ基因在mRNA和蛋白质水平的表达降低。研究结论成功构建了ppGalNAc-T10正义和反义真核表达载体,为今后进一步研究ppGalNAc-T10的生物学功能奠定基础。ppGalNAc-T10可能影响人结直肠癌细胞株LoVo细胞的增殖、迁移能力和侵袭能力,同时由于TGF-βⅠ和TGF-βRⅡ都是与肿瘤的增殖、转移浸润相关的指标,推测抑制ppGalNAc-T10的表达使恶性肿瘤细胞的整体生存能力下降,同时抑制了恶性细胞的向外迁移。