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肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌）是原发性肝癌最常见的类型,在我国每年新增肝癌病例和死亡人数均居全球前列。绝大多数肝癌患者预后差,5年生存期不足15%。肝癌的发生和发展涉及众多基因的异常表达以及相关信号通路的异常,因此深入探究肝癌发生和发展过程中的关键驱动基因,明确其作用机制,并以此为基础寻找预防和治疗肝癌的新靶点,具有重要的科学研究价值和临床实践意义。长链非编码RNA（longnoncoding RNA,lncRNA）作为一种重要的基因表达调控元件,可以在表观遗传调控、转录及转录后调控、翻译以及翻译后调控等多种层面上参与调控相关基因的表达,影响肿瘤的发生和发展过程。研究表明,lncRNA DLEU1（Deleted in lymphocytic leukaemia 1）在多种肿瘤（包括膀胱癌、宫颈癌、胰腺癌、大肠癌以及卵巢癌等）中异常表达,且与多种肿瘤的不良预后相关,在肿瘤的发生、发展过程中起重要调控作用,但是DLEU1在肝癌的发生和发展进程中的作用方式及其分子机制尚需要进一步研究。近年来的研究表明,中医药治疗肝癌在抑制瘤体生长、增加化疗药物疗效、延长患者生存期等方面具有一定优势。“癌毒”理论构建了中医肿瘤临床辨治体系,研发抗癌祛毒的中药有效成分对肝癌治疗具有重要的临床意义。清热解毒是治疗肝癌常用的抗癌祛毒治法,在肝癌治疗中获得了较好的疗效。汉黄芩素是一种具有清热解毒功效的黄酮类化合物,可通过调控多个靶点及信号通路发挥抗肿瘤作用。研究表明,Hippo信号通路的失调与肝癌的发生和发展密切相关。Hippo信号通路的核心是一个激酶级联反应,通过抑制其两个主要下游的转录共激活因子YAP（Yes-associated protein）和 TAZ（Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif）的活性发挥抑癌作用。尽管已有文献报道,汉黄芩素可以通过不同的调控方式发挥抗肝癌的药理作用,但是,汉黄芩素能否通过靶向Hippo信号通路发挥抗肝癌作用则尚未见报道。结合我们前期研究基础,在对现有相关文献资料考证的基础上,一方面,本研究将以肝癌细胞为研究对象,阐明DLEU1调控肝癌细胞增殖和凋亡的作用方式及其机制,并从肝癌组织水平和小鼠移植瘤模型水平研究DLEU1在肝癌中的作用。另一方面,本研究将探究汉黄芩素能否通过靶向Hippo信号通路调控肝癌细胞增殖、细胞周期进程以及细胞凋亡,进一步揭示汉黄芩素抗肝癌的分子机制,为中药抗肝癌治疗提供理论基础。本论文的具体内容包括以下三章:第一章LncRNA DLEU1对肝癌细胞增殖和凋亡的影响目的:明确lncRNA DLEU1对肝癌细胞细胞活力、细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期进程、细胞凋亡以及迁移的影响;研究DLEU1对小鼠体内移植瘤生长的影响。方法:为了研究DLEU1在肝癌中的作用以及对肝癌细胞生物学相关行为的影响。首先,我们通过RNA荧光原位杂交（RNA fluorescenceinsituhybridization,RNAFISH）技术检测了肝癌患者的肝癌组织和癌旁组织芯片中DLEU1的表达差异,分析了DLEU1的表达与肝癌患者的临床病理资料及生存期的相关性;其次,我们通过构建过表达和干扰表达DLEU1的肝癌细胞模型,采用CCK-8检测实验、EdU细胞增殖检测实验、细胞克隆形成实验、细胞周期检测实验、细胞凋亡检测实验以及Transwell实验研究了 DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞的细胞活力、细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期进程、细胞凋亡以及迁移的影响;最后,利用DLEU1稳定过表达和干扰表达的肝癌细胞HCCLM3建立裸鼠皮下移植瘤模型,研究DLEU1对小鼠体内移植瘤生长的影响;同时,应用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测肿瘤组织切片中细胞的凋亡情况。结果:RNA FISH实验结果显示,DLEU1在肝癌组织中表达低于对应的癌旁组织;肝癌组织中DLEU1表达水平对患者AFP表达、肿瘤大小、肿瘤数目、癌栓有无、包膜是否完整、分化等均有影响;DLEU1低表达的肝癌患者与较低的无病生存期相关。CCK-8检测实验、EdU细胞增殖检测实验、细胞克隆形成实验、细胞周期检测实验以及细胞凋亡检测实验结果显示,DLEU1过表达可以降低肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的细胞活力、抑制细胞增殖和细胞克隆形成、诱导细胞周期G1/S期的阻滞以及促进细胞凋亡,而DLEU1干扰表达则可以提高SMMC7721细胞和HCCLM3细胞的细胞活力、促进细胞增殖和细胞克隆形成、促进细胞周期G1/S期的进程以及抑制细胞凋亡;Transwell细胞迁移实验结果显示,DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的体外迁移没有显著影响;小鼠移植瘤实验结果显示,接种过表达DLEU1的HCCLM3细胞组荷瘤小鼠的瘤体体积和重量均较对照组显著降低,而接种干扰表达DLEU1的HCCLM3组荷瘤小鼠的瘤体体积及重量较对照组显著增加;同时,TUNEL实验检测结果显示,过表达DLEU1组瘤体细胞凋亡高于对照组,而干扰表达DLEU1组瘤体细胞凋亡少于对照组。结论:DLEU1在肝癌组织中低表达,且与患者无病生存期相关。体外细胞水平的研究结果表明,DLEU1过表达可诱导肝癌细胞的细胞周期G1/S期阻滞,抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞的凋亡;而DLEU1干扰表达则可以促进肝癌细胞的细胞周期G1/S期进程和细胞增殖,抑制肝癌细胞的凋亡;体内实验进一步证实了 DLEU1过表达可以抑制小鼠体内移植瘤的生长,促进肝癌细胞的凋亡;而DLEU1干扰表达则可以促进小鼠体内移植瘤的生长,抑制肝癌细胞的凋亡。第二章LncRNA DLEU1调控肝癌细胞增殖和凋亡的机制研究目的:阐明DLEU1调控肝癌细胞增殖和凋亡的分子机制;明确DLEU1可能通过调控 Hippo 通路以及 RNA m6A 修饰影响 CYR61（Cysteine-rich angiogenic inducer 61）的表达而调控肝癌细胞增殖和凋亡。方法:我们首先采用RNA sequencing（RNA-seq）检测了 DLEU1过表达的肝癌细胞SMMC7721中转录组的改变,并进行差异基因表达分析和KEGG通路富集分析。其次,通过 RT-qPCR（Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction）实验检测DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中 Hippo 通路关键效应分子 YAP/TAZ 及其靶基因 CTGF（Connective tissue growth factor）和CYR61表达的影响;采用Western blot实验检测了 DLEU1对肝癌细胞中Hippo信号通路的终末效应组分YAP/TAZ以及两个核心成分MOB1（Mps One Binder Kinase Activator-Like 1）和 LATS1（Large Tumor Suppressor Kinase 1）的表达及其磷酸化水平的影响。在明确干扰表达DLEU1的肝癌细胞中CYR61蛋白水平较转录组水平显著增高后,通过在干扰表达DLEU1的肝癌细胞中干扰表达CYR61,采用EdU细胞增殖检测实验、细胞周期检测实验以及细胞凋亡检测实验检测CYR61干扰表达对干扰表达DLEU1的肝癌细胞的增殖、细胞周期进程以及细胞凋亡的影响。第三,采用免疫组化染色实验检测肝癌组织及其癌旁组织中RNA m6A修饰的差异;采用RNA dotblot实验、免疫荧光染色实验、Western blot实验分别检测DLEU1过表达和干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中RNA m6A修饰水平、RNA m6A修饰相关的调节蛋白表达的影响。第四,采用MeRIP-qPCR（Methylated RNA immunoprecipitation-quantitative real-time polymerase chain reaction）实验检测 DLEU1干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3era中CYR61 mRNA)的m6A修饰水平的影响;通过在干扰表达DLEU1的肝癌细胞中干扰表达WTAP（Wilms’Tumour 1-Associating Protein）后,采用 MeRIP-qPCR 以及 Western blot 实验检测 WTAP 干扰表饰水平及CYR61蛋白水平的影响。第五,采用RIP-qPCR检测干扰表达DLEU1的肝癌细胞 SMMC7721 和 HCCLM3 中 YTHDC2（YTH Domain Containing 2）能否与CYR61的mRNA结合;通过在干扰表达DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中干扰表达YTHDC2后,采用Western blot实验检测YTHDC2干扰表达对干扰表达DLEU1的肝癌细胞中CYR61蛋白表达水平的影响。最后,通过建立稳定表达带Slm标签的DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3细胞模型,采用体内RNA pulldown实验,将获得的RNA pulldown沉淀物一部分进行蛋白质谱检测,另一部分进行Western blot实验验证,同时通过RIP-qPCR实验检测,明确DLEU1可以与转录因子CTCF（CCCTC-bindingfactor）结合;通过在干扰表达DLEU1的肝癌细胞中干扰表达CTCF后,采用Wcstern blot实验检测CTCF干扰表达对干扰表达DLEU1的肝癌细胞中YTHDC2和WTAP表达的影响。结果:首先,RNA-seq检测结果显示过表达DLEU1的SMMC7721细胞中有共有872个基因表达上调和211个基因表达下调,KEGG通路富集分析结果提示差异表达基因在Hippo信号通路富集明显。其次,RT-qPCR验证结果显示,DLEU1过表达可以下调肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中Hippo通路的效应分子YAP/TAZ 及其靶基因CTGF和CYR61的mRNA水平,而DLEU1干扰表达则可以上调肝癌细胞中YAP/TAZ、CTGF和CYR61的mRNA水平;同时,Western blot实验检测结果显示,DLEU1过表达可促进肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中YAP的丝氨酸127位点的磷酸化（p-YAP（S127））、TAZ的磷酸化（p-TAZ）、LATS1的Y1079位点的磷酸化（p-LATS1）和 MOB1 的磷酸化（p-MOB1）,下调 YAP/TAZ 的靶基因 CTGF 和 CYR61的蛋白水平,而DLEU1干扰表达则可以降低肝癌细胞中p-YAP（S127）、p-TAZ、p-LATS1以及p-MOB1水平,上调CTGF和CYR61的蛋白水平。EdU细胞增殖检测实验、细胞周期检测实验以及细胞凋亡检测实验检测结果显示,CYR61干扰表达可以部分逆转DLEU1干扰表达诱导的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的增殖、G1/S进程以及细胞凋亡抑制的作用。第三,免疫组化染色检测结果显示,肝癌组织中RNA m6A修饰水平显著高于对应癌旁组织;RNAdot blot实验和免疫荧光染色实验结果显示,DLEU1过表达可以下调肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中RNAm6A修饰水平,而DLEU1干扰表达则可以上调肝癌细胞中RNA m6A修饰水平;Western blot检测结果显示DLEU1过表达可以下调肝癌细胞中WTAP和YTHDC2,而DLEU1干扰表达则可以上调细胞中WTAP和YTHDC2。第四,MeRIP-qPCR检测结果显示,CYR61的mRNA在干扰表达DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中被抗m6A抗体富集显著增加;WTAP干扰表达可以引起干扰表达DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中CYR61的mRNA m6A抗体富集减少以及CYR61蛋白表达下调。第五,RIP-qPCR检测结果显示,YTHDC2在干扰表达DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中可以与CYR61的mRNA可结合;YTHDC2干扰表达可以引起干扰表达DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中CYR61蛋白表达下调。最后,体内RNApulldown实验结合蛋白质谱分析、Westernblot及RIP-qPCR实验验证结果显示,DLEU1可以与CTCF相互作用;CTCF干扰表达可以下调干扰表达DLEU1的肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中YTHDC2和WTAP蛋白的表达。结论:DLEU1可以抑制肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡,其机制可能是:一方面,DLEU1可通过调控肝癌细胞中的MOB1-LATS1的活性而激活Hippo信号通路,促进YAP和TAZ的磷酸化而下调YAP/TAZ的靶基因CTGF和CYR61的表达来实现的;另一方面,DLEU1可能通过与CTCF结合调控肝癌细胞中WTAP和YTHDC2的表达;DLEU1干扰表达促进肝癌细胞增殖和抑制细胞凋亡可能通过上调WTAP而促进肝癌细胞中总RNA m6A修饰和CYR61的mRNA m6A修饰,进一步通过上调YTHDC2,增加YTHDC2与m6A修饰的CYR61 mRNA的结合而上调CYR61的蛋白水平来实现的。第三章汉黄芩素通过激活Hippo信号通路诱导肝癌细胞周期阻滞和细胞凋亡的研究目的:明确汉黄芩素能否通过靶向Hippo信号通路调控肝癌细胞增殖、细胞周期进程以及细胞凋亡发挥抑癌作用。方法:首先,采用CCK-8试剂盒、细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测汉黄芩素对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的细胞活力、细胞周期进程和细胞凋亡的影响。其次,采用RNA-seq检测汉黄芩素处理的SMMC7721细胞中的差异基因表达谱的变化,并进行差异基因表达分析和KEGG通路富集分析;同时,通过RT-qPCR实验验证汉黄芩素处理后的肝癌细胞中差异基因表达的变化。再次,采用Western blot实验和免疫荧光染色实验验证汉黄芩素对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中Hippo通路效应分子YAP/TAZ核质定位和分布的影响;同时,采用Western blot实验研究了汉黄芩素对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中YAP/TAZ以及两个核心成分MOB1和LATS1的表达及其磷酸化水平的影响。最后,采用凋亡蛋白抗体检测芯片筛选汉黄芩素对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中凋亡相关蛋白的影响;通过在肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3中转染特异性靶向Claspin的siRNA后,通过流式细胞术检测Claspin干扰表达对肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的细胞周期进程和细胞凋亡的影响;采用建立腺病毒介导的YAP过表达以及TAZ过表达的SMMC7721细胞和HCCLM3细胞模型,通过流式细胞术和Western blot实验检测汉黄芩素能否通过Hippo通路下调Claspin表达来诱导肝癌细胞周期阻滞和细胞凋亡。此外,通过RNA dotblot和免疫荧光实验初步研究了汉黄芩素对SMMC7721和HCCLM3细胞中RNA m6A修饰的影响。结果:CCK-8实验检测结果显示,汉黄芩素以剂量依赖的方式抑制肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的细胞活力;细胞周期及细胞凋亡检测结果显示,汉黄芩素可以促进肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的G2/M期阻滞并诱导肝癌细胞凋亡。RNA-seq检测结果显示,汉黄芩素处理后的SMMC7721细胞中差异表达基因中有1578个上调、2432个下调;KEGG分析显示,汉黄芩素诱导的差异表达基因在Hippo信号通路富集明显;RT-qPCR验证结果显示,汉黄芩素可以下调肝癌细胞SMMC7721和 HCCLM3 中 CTGF、CYR61 和 Claspin,上调细胞中 p21。Western blot 及免疫荧光染色结果显示,汉黄芩素可降低肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的细胞核中YAP/TAZ分布,并增加 YAP/TAZ在细胞质中的分布;同时Western blot结果显示,汉黄芩素可上调肝癌细胞中p-YAP、p-TAZ、pLATS1和pMOB1。凋亡蛋白抗体检测芯片筛选出汉黄芩素处理后的肝癌细胞中Claspin明显下调;细胞周期和细胞凋亡检测结果显示,Claspin干扰表达可促进肝癌细胞SMMC7721和HCCLM3的G2/M期阻滞并诱导肝癌细胞凋亡;而YAP过表达或TAZ过表达均可以部分逆转汉黄芩素诱导的SMMC7721细胞和HCCLM3细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡;Western blot实验结果进一步证明,YAP过表达或TAZ过表达均可部分逆转汉黄芩素对SMMC7721细胞和HCCLM3细胞中Claspin蛋白的抑制作用。此外,RNA dot blot和免疫荧光实验结果表明,汉黄芩素可以下调SMMC7721和HCCLM3细胞的RNA m6A修饰水平。结论:汉黄芩素可能通过激活MOB1-LATS1信号抑制肝癌细胞中YAP和TAZ的活性,下调Claspin的表达,从而诱导肝癌细胞的细胞周期阻滞和细胞凋亡。