【摘 要】
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α-淀粉酶是具有广泛应用价值的一类工业用酶,其耐酸碱及热稳定的特性决定着α-淀粉酶的应用方向。为获得高效应用于饲料工业的淀粉酶,即在低p H条件及40℃环境下具有高活力和高稳定性的α-淀粉酶,本研究克隆表达了贝莱斯芽孢杆菌D1的α-淀粉酶并对其进行突变改良,采用结构生物学、计算机模拟、基因定点突变等技术进行合理设计进行分子改造,并用Escherichia coli BL21重组表达α-淀粉酶,同时
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α-淀粉酶是具有广泛应用价值的一类工业用酶,其耐酸碱及热稳定的特性决定着α-淀粉酶的应用方向。为获得高效应用于饲料工业的淀粉酶,即在低p H条件及40℃环境下具有高活力和高稳定性的α-淀粉酶,本研究克隆表达了贝莱斯芽孢杆菌D1的α-淀粉酶并对其进行突变改良,采用结构生物学、计算机模拟、基因定点突变等技术进行合理设计进行分子改造,并用Escherichia coli BL21重组表达α-淀粉酶,同时研究了改良酶的酶学性质。本研究扩增出贝莱斯芽孢杆菌α-淀粉酶ORF,测序得其全长为1980 bp,含有659个可编码氨基酸,分子量约为66 k Da。并在其C结构域中设计了P546E、H572D、A614E、K622E四个突变位点,依次进行定点突变后,得到3个突变α-淀粉酶Mut1（E）、Mut2（ED）和Mut3（EDEE）。通过酶学性质研究得到如下结果:（1）Mut1、Mut2和Mut3的最适温度约为60℃,但Mut3的最适温度达到了65℃,比原淀粉酶体Ori提高了5℃;（2）最适p H均在p H 6.0～7.0之间,但Mut2和Mut3在p H 5.0时出现了小峰值,此时酶活也较高;（3）突变前后,Ori、Mut1和Mut2在60℃,p H 7.0时比活力约为500 U/mg,而Mut3此时比活力较大约为600 U/mg。（4）Mut3在40～55℃保温4 h后,热稳定性均高于原淀粉酶Ori,且在40℃时保温4 h后的比活力也较Ori高50 U/mg;（5）在p H 2.0～5.0条件下,40℃保温4 h后,Mut1、Mut2和Mut3耐酸性均高于原淀粉酶体,其中Mut3最高,在p H 5.0保温4 h后,Mut3比活力仍有400 U/mg,并且在p H 2.0时比活力是原淀粉酶Ori的2倍。本研究还初步比较了突变淀粉酶Mut3与Ori体外酶解肉鸡饲料的效果,通过设计酶解时间、添饲量以及淀粉酶添加量三因素三水平正交实验发现Mut3对肉鸡饲料的酶解效果高于Ori组,且两组中酶解时间、添饲量都对饲料酶解效率有极显著性差异（p＜0.01）,Mut3的用量对酶解试验具有显著性差异（p＜0.05）,而Ori的用量对酶解试验无显著性影响。P546E、H572D、A614E、K622E这四个位点突变后,有效提高了淀粉酶的耐酸性质以及热稳定性,这种基于结构预测的合理设计该研究为α-淀粉酶应用于饲料行业提供了一定的依据,并且对于提高其他工业酶的耐酸性以及热稳定性具有重要参考意义。
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