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单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus typeⅠ, HSV-1)是一种重要的人类致病原,可导致从轻度的皮肤感染到致命性脑炎等不同程度的多种疾病。HSV-1基因组是一个包含有152 kbp碱基的双链线性DNA,其基因组包括至少75种蛋白编码基因。尽管目前HSV-1的大部分结构基因已经研究清楚,然而仍有很多病毒基因的功能未被阐明,同时其顺式作用元件如何调控基因的表达以及基因与基因之间的相互作用也不十分清楚,问题的困难性最终体现在HSV-1庞大而复杂的基因组上。其庞大而复杂的基因组使其在真核细胞内的基因操作如定点基因的突变及某些基因的靶向敲除变的十分困难,从而不利于HSV-1各基因功能的研究。近几年来发展的以细菌人工染色体为基础的可携带大片段外源DNA的全新技术可使HSV-1全基因组以BAC (Bacterial artificial chromosome)质粒的形式在大肠杆菌中进行保存、增殖和遗传修饰。与在真核细胞中进行的操作相比,HSV-1全基因组以质粒的形式在大肠杆菌中进行的操作具有简单快速、安全性好的优点。BAC-HSV-1质粒转染真核细胞后可重建具有感染性的HSV-1子代病毒,从而可促进HSV-1整个基因组中不同基因功能的研究。本实验利用大肠杆菌的F因子即BAC,在真核细胞内利用同源重组的方法成功构建了含HSV-1全基因组的BAC-HSV-1,其重组部位为HSV-1的复制非必须基因,且BAC的两端含有同向的loxP位点,经Cre酶作用后,可以产生不含BAC的子代重组病毒,使得对单纯疱疹病毒的各基因功能分析及遗传分析提升到了一个新的阶段,为进一步研究该病毒株的性质奠定了坚实的基础。目的1.构建由BAC携带的HSV-1质粒及携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的重组型BAC-HSV-1 HF株感染性子代病毒；2.探讨BAC-HSV-1HF株重组病毒的复制增殖能力；3.探讨BAC-HSV-1HF株重组病毒BAC元件的操作性。方法1.构建BAC-HSV-1重组质粒(1)构建携带HSV-1同源臂的质粒C223-左右同源臂质粒以HSV-1 UL43-47的侧翼序列为模板设计引物,扩增同源重组用HSV-1左右同源臂,将左右同源臂定向克隆至C223质粒的SacI和NotI位点,构建质粒C223-左右同源臂DNA。(2)C223-左右同源臂与HSV-1同源重组MluI酶切C223-左右同源臂,使其线性化,脂质体包埋法将线性化的C223-左右同源臂DNA片段转染至Vero细胞,24小时后,用MOI=0.01的HSV-1病毒感染Vero细胞,置于37。C,5% CO2培养箱中培养,经真核细胞内同源重组产生含GFP报告基因的BAC-HSV-1重组病毒。(3)噬斑纯化筛选携带绿色荧光报告基因的BAC-HSV-1重组病毒,Hirt法提取BAC-HSV-1环形DNA,电转化重组病毒环形DNA至DH10B感受态菌中,挑取BAC-HSV-1重组质粒克隆,经PCR和酶切法鉴定BAC-HSV-1重组质粒。2.质粒型BAC-HSV-1子代病毒的重建与特性研究(1)重组病毒BAC-HSV-1重建与特性研究将实验组BAC-HSV-1和对照组HSV-1基因组DNA以脂质体包埋法各转染2ugDNA至Vero细胞,48小时后荧光倒置显微镜下观察细胞病变情况和绿色荧光蛋白表达情况。72小时后收取细胞上清液,半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID50)法测定两组病毒滴度,将收获的实验组和对照组的子代病毒以MOI=0.01再次感染Vero细胞,TCID50法测定两组病毒滴度。两组将病毒滴度采用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS16.0软件分析,两组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。(2)重组病毒BAC-HSV-1中BAC的可操作性研究实验组A组Vero细胞给予MOI=2的重组复制缺陷型腺病毒Adv-Cre,18h后,以MOI=0.01的BAC-HSV-1重组病毒感染Vero细胞；实验组B组Vero细胞给予MOI=2的重组复制缺陷型腺病毒Adv,18h后,以MOI=0.01的BAC-HSV-1病毒感染Vero细胞。观察细胞生长情况,待各组细胞出现完全CPE后收集病变细胞上清液,将收集的病变细胞上清液于-80。C和37。C之间冻融3次,3000rpm/min离心10分钟,各取10ul上清液分别感染Vero细胞,24h后,荧光3000rpm/min离心10分钟,各取10ul上清液分别感染Vero细胞,24h后,荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果1.成功构建了HSV-1 HF病毒株的BAC-HSV-1质粒-病毒穿梭系统；2. BAC-HSV-1重组病毒在Vero细胞的复制增殖能力与原HSV-1病毒相比差异无统计学意义(P=0.079)；3.成功重建不含BAC元件的BAC-HSV-1HFΔBAC子代病毒。结论重组BAC-HSV-1可以质粒/病毒的形式在真核/原核细胞间穿梭;BAC-HSV-1重组病毒在Vero细胞的复制增殖能力与原HSV-1病毒相比差异无统计学意义；经Cre/loxP系统可移除BAC-HSV-1中的BAC元件,BAC-HSV-1的BAC元件具有可操作性。