伴性油蚕(os)的分子标记定位及形成机理初探

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在过去的100余年中,突变基因的遗传学研究一直是家蚕遗传学研究中十分重要的内容和热点之一。通过对突变基因的遗传分析所发现的性状遗传规律以及通过连锁定位研究构建起的连锁遗传图谱,是家蚕遗传育种研究的重要理论基础,也为家蚕分子基因图谱的绘制奠定了重要的基础,更是分离克隆家蚕突变基因的理论依据。油蚕是家蚕中的一类特殊突变,因其幼虫真皮细胞中尿酸盐结晶含量降低,使皮肤呈现透明状,因看起来似一层油纸而得名。迄今共发现了40多个油蚕突变,其基因分别分布在15个染色体上。伴性油蚕(sex linked translucent, os)是家蚕中最早报道的油蚕突变,皮肤透明度低,伴性遗传,在家蚕连锁遗传图谱上的基因位点为:1-0.0。本研究利用西南大学家蚕基因库培育的伴性油蚕(os)的近等位基因系“大造os"和近交系C108 (BmIS-C108),试图通过定位克隆策略分离该基因,为探明该突变基因的分子机制奠定基础。已开展的研究内容和取得的研究结果包括以下几方面:(1)配制杂交组合材料本实验配制的杂交组合材料有两种,首先是配制连锁杂交组合:将“大造os"雌(ZOSW)和C108雄(Z+Z+)进行杂交,得到F1代(Z+W、Z+ZOS),选F1代雌(Z+W)与“大造os”雄(ZosZOS)进行回交,就得到回交1代(Backcross 1, BC1)材料,又因在回交时用的F1雌(Female),所以连锁组合材料又用BC1F来表示;其次是配制定位组合材料:将“大造os"雄(zoszos)和C108雌(Z+W)进行杂交得到F1代(ZOSW、Z+ZOS),再选取F1代雄(Z+ZOS)与“大造os”雌(ZOSW)进行回交,得到回交1代材料,此次回交用的是F1代雄(Male),所以定位组合材料用BC1M表示。(2)伴性油蚕(os)的SSR分子标记初步定位选取已发表的家蚕微卫星(SSR)分子标记连锁图的第一连锁群的6对SSR分子标记引物,利用20个BC1F回交个体和156个BC1M回交个体,通过SSR-PCR方法以及作图软件(Joinmap 4.0, LOD=5.0)分析,得到家蚕伴性油蚕(os)基因与SSR标记的连锁图谱,连锁图的图距为55.0cM,图中与突变基因os距离最近的标记是S0105,标记S0105和基因os间的图距为38.1cM。(3)新标记筛选与伴性油蚕(os)的进一步定位根据初步定位结果,我们将os候选基因锁定在家蚕基因组精细图的nscaf2734及其以外的gap区域,再利用Go分类、cluster聚类分析,筛选出可能参与氮代谢、GTP合成、物质转运等通路的基因作为os突变的候选,根据这些基因的物理位置,选取其中部分基因设计新标记,进行多态性筛选及进一步的定位。同样利用20个BC1F回交个体和156个BC1M回交个体,通过SSR-PCR的方法以及作图软件(Joinmap 4.0, LOD=5.0)分析,将os基因定位在分子标记S0105和新标记Vp之间,距离os基因最近的标记Vp只有1.6cM.(4)伴性油蚕(os)的代谢产物分析运用HPLC检测技术,检测得知0.5g正常蚕“大造”蚕沙中含尿酸量约为114.92μg,而相同时期相同数量的伴性油蚕近等位基因系“大造-Os”蚕沙中没有检测到尿酸含量。根据这一实验结果,我们初步推测os油蚕的形成是尿酸生成缺陷型。(5)伴性油蚕(os)的候选基因初步筛查通过整合第一连锁群分子标记图谱与基因组物理图谱的对应关系,我们初步确定了候选基因筛查范围:nscaf3040:3800k-end-nscaf2734:1400k-end。基于分子标记定位结果及生理学分析结果,对于在初步确定的候选基因范围内的基因进行Go分类、分子功能和生物合成途径的分析等生物信息学分析,筛查出3个候选基因:BGIBMGA012225、BGIBMGA012226和BGIBMGA012356。
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