脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)往往导致患者终生残疾,造成沉重的社会和家庭负担。脊髓损伤后的一系列病理改变,如炎症反应、脂质过氧化、谷氨酸兴奋性毒性、局部脉管紊乱、轴突脱髓鞘等,都使得脊髓损伤的病情复杂化,临床治疗难以找到有效突破口。其中,炎症反应过程是脊髓损伤后最为重要的病理进程之一,巨噬细胞在脊髓髓损伤后的炎症反应中扮演者重要的角色,对SCI的内环境起决定性作用。SCI后巨噬细胞活化为M1和M2两个功能不同的亚群,M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等对神经元和胶质细胞起毒性作用;M2型巨噬细胞通过分泌抑制性细胞因子IL-10和/或TGF-β等下调免疫应答,减少对存活神经细胞的损害,由此可见M2型巨噬细胞可以减轻SCI后的炎症反应。因此SCI的预后可能受不同炎症环境的影响。近年来,人们通过高压氧、局部移植神经祖细胞等方法治疗脊髓损伤,都取得了一定的成效,但是其引起的物理及化学反应使得运用前景不佳。弱激光因具有较好的生物接触效应并安全稳定,使得其在皮肤美容、针灸理疗等医学领域被广泛使用,并且取得了值得肯定的临床治疗效果。弱激光在减轻SCI后炎症反应和神经功能恢复方面的作用也得到了越来越广泛的共识,越来越多的研究结果表明使用弱激光照射可以明显抑制SCI早期促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达,促进抑炎细胞因子il-10的表达。那么弱激光是否是通过调控巨噬细胞的m1/m2极化分型来调控sci后继发性炎症反应从而促进sci修复和临床康复的呢?为此,此次实验以sci后的局部炎症反应与功能康复的关系为切入点,通过探讨不同能量参数弱激光照射对体外培养的m1型巨噬细胞活力及极化状态的影响,以及不同功率弱激光照射对大鼠脊髓损伤后局部m1/m2巨噬细胞数量和状态的影响,从而为调控sci炎症环境,促进运动功能恢复寻找策略。首先,我们体外分离、培养balb/c-wt小鼠来源的骨髓巨噬细胞,通过流式细胞仪鉴定培养结果。用lps对培养成熟的骨髓巨噬细胞进行m1极化诱导,通过q-pcr和westernblot检测m1型巨噬细胞特异性基因的表达,观察其向m1极化的情况。应用不同能量(1,2,3,4j/cm2)的810nm弱激光对体外培养的m1细胞进行照射,并选用mtt、免疫荧光化学染色、qpcr和westernblot方法,观察不同能量的810nm弱激光对m1细胞活力和细胞极化的影响。随后,我们在构建标准化的大鼠脊髓损伤模型基础上,运用上述能量参数的810nm弱激光对大鼠脊髓损伤区进行照射。7天后选用bbb评分、足印记实验观察不同功率弱激光照射对大鼠运动功能的恢复的影响。随后灌注取材,选用qpcr、westernblot和免疫荧光化学染色方法,观察不同功率弱激光对大鼠损伤区m1/m2巨噬细胞比例及状态的影响。通过上述实验我们得到以下结果:应用m-csf条件性培养基培养的骨髓细胞,经流式细胞检测发现细胞的f4/80阳性率达98%。骨髓源性巨噬细胞在lps-inf-γ刺激下,高表达inos和cd86的mrna。westernblot检测发现,给于极化刺激后,骨髓源性巨噬细胞高表达inos和cd86蛋白。不同能量的弱激光照射m1型巨噬细胞,mtt检测发现,弱激光参数为1、2、3j/cm2时m1细胞活力与对照组比较没有明显差异,参数为4j/cm2时m1细胞活力降低。细胞免疫荧光显示,与对照组比较,照射剂量为1、2j/cm2时,m2型标志物arg1阳性细胞数无明显差异,照射剂量为3、4j/cm2时m2型标志物arg1阳性细胞数显著增多,m1型标志物inos阳性细胞数显著减少。qrt-pcr及westernblot检测发现,与对照组比较,照射剂量为1、2j/cm2时inos及arg1mrna和蛋白表达水平没有明显变化,在照射剂量为3、4/cm2时,m1型标志物inosmrna和蛋白水平表达下降,m2型标志物arg1mrna和蛋白水平表达升高。BBB评分和足印记实验显示,与对照组比较,照射功率为1、2J/cm2时大鼠运动功能恢复无明显差异,照射剂量为3、4J/cm2的弱激光能促进大鼠运动功能恢复。细胞免疫荧光显示,与对照组比较,照射剂量为1、2J/cm2时,大鼠脊髓损伤区Arg-1阳性细胞数无明显差异,照射剂量为3、4J/cm2时Arg-1阳性细胞数显著增多,iNOS阳性细胞数明显减少。qRT-PCR及western blot检测发现,与对照组比较,照射剂量为1、2J/cm2时iNOS及Arg-1 mRNA转录和蛋白表达水平没有明显变化,在照射功率为3、4J/cm2时,iNOS mRNA转录和蛋白表达水平下降,Arg-1 mRNA转录和蛋白表达水平提高。研究结果提示:能量为1、2J/cm2的810nm弱激光对M1型巨噬细胞的活力和极化状态没有明显影响。能量为3J/cm2的810nm弱激光促使M1型巨噬细胞向M2型极化,但对细胞活力没有明显影响。能量为4J/cm2的810nm弱激光也可促使M1型巨噬细胞向M2型极化,但细胞活力降低;能量为1、2J/cm2的810nm弱激光照射对大鼠脊髓损伤区M1/M2巨噬细胞数量变化无显著作用,3、4J/cm2的810nm弱激光照射使损伤区M2型巨噬细胞数量增多,M1型巨噬细胞数量减少,并促进大鼠运动功能恢复。