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结直肠癌(CRC)是临床常见的癌症类型之一,每年大约有120万新结直肠癌确诊病例,而每年死于结直肠癌患者人数约为60万。化疗药物耐药的出现是结直肠癌高死亡率的一个重要原因,了解导致个体化疗药物耐药的机制有助于确定新的药物靶点和药物研发,从而改善癌症治疗。本课题组前期发现B7-H3能够促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。因为肿瘤转移和化疗耐药具有密切联系,在本课题中,我们以B7-H3为靶点探究其与结直肠癌细胞耐药的关系。首先,我们分析了共刺激分子B7-H3在HCT-116、HCT-8、HT29、SW480、SW620、RKO、LOVO细胞中的表达。Westernblot结果发现,相对于SW480、SW620、RKO、LOVO细胞,B7-H3在HCT-8、HT29、HCT-116细胞中有更高的表达。我们发现B7-H3分子在HCT-8/5-Fu以及HCT-116/L-OHP两组耐药细胞中的表达均高于其野生细胞(HCT-8,HCT-116)。为了评估B7-H3分子对CRC细胞药物敏感性的影响,我们使用特定的siRNA沉默了HCT-116和HCT-8细胞中B7-H3的表达。药物敏感性实验结果显示HCT-116/RNAi和HCT-8/RNAi细胞对奥沙利铂的敏感性高于HCT-116/Scrambled和HCT-8/Scrambled细胞。进一步的实验验证中,我们构建了两株B7-H3稳定过表达细胞(即SW480-B7H3和SW620-B7H3)及其各自的对照(即SW480-NC和SW620-NC)。结果发现,与它们的对照组细胞相比,SW480-B7H3和SW620-B7H3细胞对奥沙利铂更耐受。随后我们还评估了B7-H3分子表达对奥沙利铂诱导的CRC细胞凋亡和DNA损伤的影响。结果提示,低表达B7-H3的CRC细胞(即HCT-8/RNAi和SW480-NC)对奥沙利铂诱导的凋亡和DNA损伤更敏感。实验中,我们发现CRC细胞中DNA损伤修复蛋白XRCC1表达与B7-H3有关。实时定量PCR,westernblot和免疫荧光结果表明,XRCC1在mRNA水平和蛋白水平上的表达与B7-H3一致,SW480-B7-H3和HCT-8/Scrambled细胞表现出比较高的XRCC1表达而SW480-NC和HCT-8/RNAi细胞XRCC1表达少。并且免疫荧光染色显示用奥沙利铂处理后,XRCC1沉默的SW480-B7H3细胞DNA损伤增加。以上实验表明B7-H3能通过促进XRCC1表达抑制药物对细胞造成的DNA损伤。通过上述实验我们观察到B7-H3通过上调XRCC1来增强CRC细胞耐药性和DNA损伤修复的现象,本课题对两者所涉及的信号通路也进行了初步探究。据报道,XRCC1的表达受PI3K/AKT和MAPK-ERK1/2信号通路的调控。在随后的实验中,我们用westernblot检测这两条通路中关键蛋白AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2在HCT-8/Scrambled、SW480-B7H3细胞及其阴性对照组(HCT-8/RNAi、SW480-NC)细胞中的表达情况。结果显示,在SW480-B7H3和HCT-8/Scrambled细胞中磷酸化的AKT(p-AKT)表达水平较高,而磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平则没有显著变化。因此推测PI3K-AKT可能是B7-H3调节XRCC1表达的主要途径。为了证实这一假设,我们用LY294002(PI3K的特异性抑制剂,100μM)阻断SW480-NC和SW480-B7H3细胞中的AKT通路。结果显示,当用LY294002处理SW480-B7-H3细胞后,B7-H3诱导的AKT磷酸化以及XRCC1表达被阻断。这些结果证实PI3K-AKT通路参与了B7-H3介导的XRCC1的调控,而且在LY294002抑制PI3K-AKT信号通路后,SW480-B7H3细胞对奥沙利铂诱导的DNA损伤和细胞死亡更加敏感。综上所述,我们的研究表明,B7-H3通过PI3K/AKT信号通路以促进XRCC1的表达,从而降低奥沙利铂诱导的DNA损伤。这些发现为B7-H3在癌症治疗中的作用提供了新的见解,并且可能对克服化疗耐药的靶向治疗药物的开发具有重要意义。