药物-小分子复合物,包括共晶和共无定形,是药物活性成分(active pharmaceutical ingredient,API)和共晶前体(co-crystal former,CCF)及共无定形前体(co-amorphous former,CAF)以氢键的形式进行超分子组装而成的新固态形式,是改善API理化性质的新技术和新思维。阿折地平是新型二氢吡啶类钙离子拮抗剂,与同类药物相比,在治疗中度和重度高血压的同时,具有利尿、心脏保护性、肾保护性、抗动脉硬化等优势。阿折地平有两个同质异晶体:晶型α和β,两种晶型的水溶性都很低。这两种晶型的分子排布和空间堆积方式不同从而有着不同的理化性质,如α-晶型的溶解度较β-晶型高,但α-晶型为亚稳态晶型,在合适的条件下可转化成β-晶型。研究表明药物-小分子前体复合物的形成可以有效地改善难溶性药物的溶解度、溶出速率、稳定性,从而改善药物的生物利用度。目的:本文的目的之一是以阿折地平的两个晶型为模型API,筛选能与之形成复合物(包括共晶和共无定形)的前体分子,制备基于两个晶型的复合物新的固态形式,并对其进行固态表征和溶解度、溶出速率等理化性质进行评价,分析复合物超分子中两组分的相互作用力的类型;探索不同晶型对复合物的形成和理化性质的影响;本文的目的之二是通过模拟人体的生理环境,研究筛选出来的各复合物与人血清白蛋白(HSA)相互作用,从而从分子水平上探索API-小分子超分子复合物形成后,API与HSA的作用方式和规律发生何种变化。方法:以阿折地平两个晶型为API模型,以草酸和哌嗪两个生物相容性的小分子为CCF或CAF分子,采用溶剂(乙醇)辅助湿研磨法(solvent assisted grinding,SG)和干粉末研磨法(neat powder grinding,NG)进行复合物的筛选。此外,采用荧光光谱法和紫外可见光谱法对复合物与HSA的相互作用进行研究。1复合物表征:制备API/CCF(CAF)摩尔比分别为2:1、1:1和1:2的阿折地平(α或β)-草酸复合物和阿折地平-哌嗪复合物样品;采用X-射线粉末衍射法(PXRD)、差示扫描量热法(DSC)、热重分析法(TG)、温度调制差示扫描量热法(tmdsc)、冷场发射扫描电子显微镜法(sem)、傅里叶红外光谱法(ft-ir)和固态核磁共振光谱(ssnmr)技术对阿折地平-草酸复合物和阿折地平-哌嗪复合物进行确证和初步研究。2复合物理化性质评价:采用摇瓶法测定α-阿折地平、β-阿折地平原料药及各自阿折地平-草酸复合物和阿折地平-哌嗪复合物在0.1mol/l盐酸溶液和0.01mol/l盐酸溶液2种介质中的平衡溶解度;采用桨法测定α-阿折地平、β-阿折地平原料药及各自阿折地平-草酸复合物和阿折地平-哌嗪复合物在0.1mol/l的盐酸溶液中的溶出速率;根据药典记载的引湿性测定法在25±1°c、相对湿度75%±1%条件下测定了α-阿折地平、β-阿折地平原料药及各自阿折地平-草酸复合物和阿折地平-哌嗪复合物的引湿性。通过对阿折地平复合物溶解度、溶出速率及吸湿性等相关理化性质的测定,探索不同晶型对复合物的形成和理化性质的影响。3在生理条件下,利用荧光光谱和紫外-可见光谱分别研究α-阿折地平、α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物、α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)复合物和阿折地平-哌嗪1:2(ng)复合物与hsa的相互作用。确定荧光猝灭机制、结合常数和结合位点数,并通过公式计算热力学参数,讨论了结合力类型。使用同步荧光光谱研究α-阿折地平、α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物、α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)复合物和阿折地平-哌嗪1:2(ng)复合物对hsa二级结构的影响。通过此研究探明不同ccf(caf)和同一ccf(caf)、不同的摩尔比对api与hsa的作用规律的影响。结果:1α-阿折地平和β-阿折地平与草酸以不同方法(sg和ng)、不同比例(2:1,1:1和1:2)筛选出12个复合物,经pxrd表征验证,α-阿折地平-草酸2:1(sg)和β-阿折地平-草酸2:1(sg)2个样品的pxrd出现新的衍射峰,初步判断形成了共晶;α-阿折地平-草酸2:1(ng)、α-阿折地平-草酸1:1(sg和ng)、α-阿折地平-草酸1:2(sg和ng)、β-阿折地平-草酸2:1(ng)、β-阿折地平-草酸1:1(sg和ng)、β-阿折地平-草酸1:2(sg和ng)10个样品的pxrd图显示为无特征衍射峰的衍射晕,初步判断为共无定形。经dsc和tg分析,2个共晶样品的熔点均为130.4°c;经tmdsc测定β-阿折地平-草酸2:1(ng),1:1(sg),1:1(ng),1:2(sg),1:2(ng)和α-阿折地平-草酸2:1(ng),1:1(sg),1:1(ng),1:2(sg),1:2(ng)10个共无定形样品的tg分别为112.6°c、134.1°c、134.4°c、76.3°c、110.4°c、112.5°c、134.7°c、134.8°c、77.3°c和110.8°c;sem显微图片进一步显示出两个共晶样品与α-阿折地平和β-阿折地平一样,均呈现出或块状或片状的晶态本质,而共无定形样品均呈现出没有固定形状的球形颗粒;ft-ir和ssnmr图谱的结果表明:阿折地平与草酸之间存在n-h···o和o-h···o氢键;溶解度测定结果表明,所有样品在0.1mol/l盐酸介质中的溶解度均比0.01mol/l盐酸中大,在0.1mol/l盐酸溶液中α-阿折地平和β-阿折地平的溶解度分别为268.40±3.2μg/ml和222.46±2.8μg/ml;在筛选出来的12个复合物中溶解度最大的分别为α-阿折地平-草酸1:2(ng)为541.35±5.2μg/ml和β-阿折地平-草酸1:2(ng)为495.05±6.0μg/ml;在0.1mol/l盐酸介质中的溶出试验中,α-阿折地平和β-阿折地平的t50分别为292.61min和803.44min,12个复合物样品中t50最小的分别为α-阿折地平-草酸1:2(ng)为55.59min和β-阿折地平-草酸1:2(ng)为53.89min。统计结果显示α-阿折地平-草酸1:2(ng)和β-阿折地平-草酸1:2(ng)与各自的原料药阿折地平单体相比有显著性差异(p<0.05)。2虽然阿折地平的两种晶型均可以和草酸形成共无定形复合物,但是α-阿折地平-草酸复合物与β-阿折地平-草酸复合物的形成过程明显不同。pxrd显示共无定形复合物形成过程中,当α-阿折地平与草酸共研磨时,需要20min就可以完全形成新的复合物;当β-阿折地平与草酸共时,直至研磨时间延长至60min时,pxrd谱图中才出现象征共无定形的衍射晕。ft-ir光谱中,当β-阿折地平和草酸以2:1和1:1的比例制备样品时,其酯羰基的伸缩振动向低波数移动了16cm-1,这是因为β-阿折地平同质二聚体中的一个氢键转换为异质二聚体共无定形复合物中的另一个氢键。而当β-阿折地平/草酸的比例为1:2时,ir谱图在1750cm-1处出现了自由的酯羰基的伸缩振动吸收,这表明更多的草酸分子的介入,破坏了β-阿折地平的晶体,使酯羰基游离了出来。然而,对于α-阿折地平复合物体系,即使是在草酸含量较低的比例的复合物中,ir谱图在1750cm-1处就可以观察到自由的酯羰基的吸收,说明α-阿折地平的晶体结构更容易被外界引入的分子破坏,更容易形成新的超分子体系。3α-阿折地平和β-阿折地平与哌嗪以不同方法(sg和ng)、不同比例(2:1,1:1和1:2)制备的12个复合物经pxrd初步表征为α-阿折地平-哌嗪1:2(sg)和α-阿折地平-哌嗪1:1(sg)2个样品出现新的衍射峰,即共晶的形成;α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)、α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)、α-阿折地平-哌嗪2:1(ng)3个样品出现无特征衍射峰的衍射晕,即共无定形形成。而α-阿折地平-哌嗪2:1(sg)样品及β-阿折地平与哌嗪制备的6个样品的pxrd图均与β-阿折地平基本一致,未形成新的复合物;经dsc和tg分析2个共晶样品的熔点均为163.2°c,但是α-阿折地平-哌嗪1:1(sg)共晶中在192.6°c还出现一个吸热峰,经推测应为富余的α-阿折地平在乙醇研磨中转化为β-阿折地平;经tmdsc测定3个共无定形样品α-阿折地平-哌嗪1:2(ng),1:1(ng)和2:1(ng)的tg分别为74.6°c,66.8°c和77.9°c;sem显微图片进一步显示出共晶样品与α-阿折地平一样,均呈现出块状的晶态本质,而共无定形样品均为球形颗粒;ft-ir和ssnmr图谱可以推测阿折地平与哌嗪形成复合物中存在n-h···o和o-h···o氢键。在0.1mol/l和0.01mol/l盐酸介质中,α-阿折地平的溶解度为268.40±3.2μg/ml和104.85±1.0μg/ml;在0.1mol/l盐酸介质中,α-阿折地平-哌嗪1:2(sg)溶解度最大为552.81±2.2μg/ml,在0.01mol/l盐酸介质中,α-阿折地平-哌嗪2:1(ng)溶解度最大为108.37±5.6μg/ml;在0.1mol/l盐酸介质中的溶出试验中,α-阿折地平的t50为292.61min,样品中t50最小的为α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)为38.70min。统计结果显示α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)与原料药α-阿折地平单体相比有显著性差异(p<0.05)。4在291、298和310k温度下,荧光光谱图显示α-阿折地平、α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)、α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)复合物和α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物对hsa均有猝灭作用。紫外光谱初步显示四种样品与hsa相互作用的猝灭机制均为静态猝灭。同步荧光光谱中,当Δλ=15nm时,四个样品加入后最大发射波长没发生明显的位移,当Δλ=60nm时,四个样品加入后最大发射波长均有轻微的红移(从283nm移动至287nm)。在291、298和310k温度下,α-阿折地平与hsa相互作用的猝灭常数分别为1.767、1.729、1.584×104l/m,α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)复合物的猝灭常数分别为1.858、1.757、1.528×104l/m,α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)复合物的猝灭常数分别为1.753、1.681、1.606×104l/m,α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物的猝灭常数分别为4.590、4.557、4.148×104l/m;α-阿折地平与hsa相互作用的结合常数分别为0.839、0.977、1.862×103m-1,α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)复合物结合常数分别为0.754、0.786、1.099×103m-1,α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)复合物结合常数分别为0.566、2.110、3.134×103m-1,α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物结合常数分别为9.168、8.568、5.800×103m-1。结论:1pxrd图中样品的新峰、dsc和tg分析中新熔点的出现、sem显微图中或块状或片状的形态特点均表明阿折地平与草酸和哌嗪形成了新的晶态复合物即共晶;pxrd图中样品的典型衍射晕、tmdsc分析中出现玻璃转化温度、sem显微图中或大或小的球状颗粒均表明阿折地平与草酸和哌嗪形成了新的无定形复合物即共无定形。由ft-ir谱图推测阿折地平-草酸复合物以草酸的c=o基团与阿折地平的n-h基团和阿折地平的c=o基团与草酸的o-h基团形成的氢键相互作用而成;阿折地平-哌嗪复合物以阿折地平的c=o基团与哌嗪的n-h基团形成的氢键相互作用而成。不同晶型与载体形成的复合物之间的差异可以根据ft-ir和ssnmr谱图中峰位的不同来进一步确证。2阿折地平复合物溶解度和溶出速率的测定结果表明,共晶和共无定形的形成可以显著改善阿折地平原料药的理化性质,是改善难溶性药物的有效方法之一,也为提高药物在体内的生物利用度提供可行性。3pxrd说明α晶型比热力学稳定晶型β更容易与草酸形成新的复合物;ft-ir谱结果说明复合物形成过程中α-阿折地平共无定形系统与β-阿折地平共无定形系统的分子间作用力不同。4α-阿折地平、α-阿折地平-哌嗪1:2(ng)复合物、α-阿折地平-哌嗪1:1(ng)复合物和α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物对hsa的相互作用的研究结果表明,复合物的形成引起了猝灭常数和结合常数的改变,尤其是α-阿折地平-草酸1:1(ng)复合物对hsa的作用与α-阿折地平相比有很大改变;与此同时,同一载体不同比例制备的复合物、同一比例不同载体制备的复合物与hsa相互作用的猝灭常数和结合常数也不同。不同温度下四个样品与hsa的相互作用的结合常数较大,说明与hsa之间有较强的结合作用,可以被hsa所储存和运输。结合常数的差异表明不同药物与HSA的结合功能不同。当温度升高时,α-阿折地平-草酸1:1(NG)复合物对HSA的Kb值降低,说明形成的化合物不稳定,在温度升高时会发生API与蛋白的离解,因此经HSA携带的药物α-阿折地平-草酸1:1(NG)复合物可以释放出来,从而实现治疗的效果。