肝素酶Ⅰ（Hep Ⅰ）是一种可以特异性将肝素降解为低聚糖或不饱和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制备,体外循环中肝素的消除以及肝素精确结构的确定。本文选择了三种不同来源的肝素酶I,构建可溶性表达肝素酶I的大肠杆菌表达系统,制备了三种重组肝素酶I,对其表达过程和酶学性质进行研究,并对肝素酶I与底物肝素的作用方式进行了初步探索,主要研究内容包括:1)选择来源于Bacteroides eggerthii VPI T5-42B-1、Bacteroides xylanisolvens SDCC 2a和Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的三种肝素酶I,分别命名为BeHep Ⅰ、BxHep Ⅰ和BcHep Ⅰ,各自编码394、381和389个氨基酸残基。成功构建了三种pET-28a-Hep Ⅰ表达载体,通过E.coli BL21（DE3）表达可溶性肝素酶I。2)对三种重组肝素酶Ⅰ进行表达研究。诱导BeHep Ⅰ的最适IPTG浓度为0.1mM,温度为30℃,诱导时长为6 h,得到的粗酶活力为5038 U·L^-1。经镍柱亲和纯化后,得到了一条分子量为42.23 kDa的明显目的蛋白条带。其比活力为480 U·mg^-1。BxHep Ⅰ的最佳表达条件为:0.2 mM的IPTG在25℃诱导7 h,得到的粗酶活力为7144 U·L^-1。镍柱亲和纯化得到一条分子量为43.06kDa的目的蛋白条带,比活力为57.6 U·mg^-1。BcHep Ⅰ的最适表达条件为:0.05 mM IPTG在30℃诱导表达12 h,得到的肝素酶I粗酶总活为7005.4U·L^-1。通过Ni-NTA纯化后,SDS-PAGE结果显示得到了单一的目的蛋白条带,比活力为639.5 U·mg^-1。3)对三种重组肝素酶Ⅰ的酶学性质进行研究。BeHep Ⅰ在40 mM,pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中相对酶活力最高。BeHep Ⅰ的最适反应温度为30℃,在此温度下半衰期为350 min。1 mM Ca²⁺对BeHep Ⅰ活力具有69%的提升作用,而Zn²⁺可以完全抑制BeHep Ⅰ的活性。BeHep Ⅰ的K_m值为3.6 mg·mL^-1,V_max为647.93 U·mg^-1。BeHep Ⅰ在4℃储存一周后活力可以保持89.1%。BxHep Ⅰ最适反应温度和pH为:35℃,pH 7.5。Ca²⁺和Mg²⁺可以促进BxHep Ⅰ的酶促反应速率,而Zn²⁺和Co²⁺抑制BxHep Ⅰ的活力。BxHep Ⅰ的K_m值为0.79mg·mL^-1,V_max为124.58 U·mg^-1。BxHep Ⅰ在30℃保温时半衰期为597 min,37℃下半衰期约为158 min。在4℃储存7天后,肝素酶I活力为初始活力的73%。BcHep Ⅰ在35℃,pH 7.5的条件下能够达到最高的比活力。Ca²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺对酶活力有不同程度的促进作用,而Co²⁺和Zn²⁺使酶活力降低。BcHep Ⅰ的K_m值为0.17 mg·mL^-1,V_max值为740.58 U·mg^-1。BcHep Ⅰ在30℃半衰期为300 min,37℃半衰期为59 min。BcHep Ⅰ在4 ^o C和-20℃储存3天后,活力均能够保持81%,在4℃储存时半衰期约为10天。4)通过同源建模和分子对接分析肝素酶Ⅰ与底物肝素的作用方式。对BeHep Ⅰ而言,肝素通过Lys99、Arg101、Gln241、Lys270、Asn275和Lys292六个高度保守的氨基酸残基与BeHep Ⅰ进行结合,形成的8个氢键较BsHep Ⅰ和BtHep Ⅰ中形成的氢键短,说明了BeHep Ⅰ活力较高;建模之后BeHep Ⅰ的构象熵较小,验证了该酶的稳定性良好。BxHep Ⅰ与肝素通过Asn25、Gln27、Arg88、Lys116、His156、Arg161、Gln228、Tyr356、Lys358和Tyr362十个氨基酸残基进行结合,BxHep Ⅰ与肝素之间形成的13个氢键增强了蛋白-配体的稳定性,最小的构象熵也证明了BxHep Ⅰ优良的稳定性。而Arg88、His156、Tyr356和Tyr362这四个残基形成较大的空间位阻,阻碍了蛋白与配体的结合,因而降低了酶与蛋白的亲和力以及酶的催化活力,这解释了BxHep Ⅰ的K_m值较大,比活力较低的原因。BcHep Ⅰ与肝素的结合涉及Gln15、Lys74、Arg76、Lys104、Arg149、Gln208、Tyr336、Tyr342和Lys338九个氨基酸残基,与底物肝素形成了11个氢键,且结构中不含侧链较大的His,避免了额外的空间位阻的形成,因而相比于BeHep Ⅰ和BxHep Ⅰ,K_m值更小,比活力更高。