论文部分内容阅读
背景和目的树突状细胞(DC)是迄今最为重要的专职抗原提呈细胞,它与其它抗原提呈细胞的最大区别在于它能使初始T细胞致敏。此外,DC也参与固有免疫应答。因此,DC在固有免疫和适应性免疫之间起着重要的桥梁作用。RA即维甲酸,是维生素A在胞内氧化代谢产生的活性衍生物,具有广泛免疫调节作用。IL-5是由活化T细胞及肥大细胞分泌的细胞因子,它能促进嗜酸性粒细胞的增殖分化,也能促进B细胞的分化及IgA的产生。IL-6是由单核-巨噬细胞和T细胞分泌,它能促进T、B细胞的增殖分化,并且在IgA产生中起着重要作用。近年来,肠道DC功能研究是免疫学研究领域的热点之一,报道了很多具有重要价值的发现,如肠道DC参与肠道T和B淋巴细胞的归巢,参与胸腺外Treg诱导生成,参与肠道免疫耐受以及一些肠道自身免疫性疾病的发病机制。最近,Mora等发现肠相关淋巴组织DC能表达RA,诱导肠道活化B细胞表达小肠归巢受体,从而使抗原激活的B细胞向小肠黏膜固有层归巢,并分化为浆细胞及分泌IgA抗体;肠外组织来源的DC不产生RA,所以无此功能。体外实验证实,相比其它来源DC,MLN-DC或PP-DC显著促进活化B细胞分泌IgA抗体,并且不需要T细胞辅助或其它因素。MLN-DC或PP-DC促进IgA产生的作用不是通过扩增已经过IgA类型转换的B细胞实现的,而是通过诱导B细胞发生IgA类型转换,并最终分泌IgA完成的。在肠外DC(如脾脏DC,肝脏DC,脾脏DC来源的DC细胞系D1-DC)存在时,RA联合IL-5和/或IL-6也能显著促进B细胞IgA产生。然而,其前题是必须有DC存在,提示DC在T细胞非依赖性IgA的产生中起着关键作用。但是,DC究竟提供了什么样的信号,是通过细胞与细胞的直接接触起作用,还是通过分泌的可溶性介质起作用,抑或是由于RA与IL-5和/或IL-6联合作用于DC,增强DC的功能,间接作用于B细胞,而促进B细胞IgA的产生?迄今未知!Tezuka等证实人肠道PP及MLN存在一类高表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的DC,而在肠外组织DC中此酶的表达很低。iNOS能诱导DC自身表达BAFF及APRIL,后两者通过与B细胞膜上特异受体结合诱导B细胞发生IgA类型转换。最近发现RA能促进一些人肿瘤细胞株表达iNOS。这些发现提示:RA联合IL-5和/或IL-6很可能通过诱导DC表达iNOS或者BAFF和APRIL,从而诱导B细胞发生IgA类型转换。RA联合IL-5和/或IL-6是否也促进DC表达经典的MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子、共刺激分子及黏附分子,从而诱导初始T细胞分化为Th2细胞,进一步介导T细胞依赖的IgA产生?这些问题都有待进一步阐明。因此本课题旨在研究RA联合IL-5和/或IL-6对DC表型及功能的影响,从而为进一步阐明它们促进B细胞分泌IgA抗体的作用机制打下基础。方法1.细胞处理:收集培养于RPMI-1640培养基的DC细胞系DC2.4,洗涤后把细胞配成10~6cell/ml,铺于24孔板,每孔1 ml,并以9种方式处理(RA浓度为100nM,IL-5和IL-6浓度均为10ng/ml):空白对照组,即DC组;DC+RA组;DC+RA+IL-5组;DC+RA+IL-6组;DC+RA+IL-5+IL-6组;DC+IL-5组;DC+IL-6组;DC+IL-5+IL-6组;DC+LPS(1μg/ml)组。把24孔板放入37℃含5%CO2的孵箱内孵育。2.DC表型分析:收集处理2天的各组DC,用流式细胞仪检测MHC-I类及Ⅱ类分子、CD86、CD80、CD54表达。3.MLR检测经处理的DC抗原提呈功能改变:收集处理2天的各组DC,用MTT法检测经处理的各组DC刺激同种异型T淋巴细胞扩增的能力。4.RT-PCR检测DC表达iNOS、APRIL及BAFF情况:收集处理12h、24h、36h、48h、及72h的各组DC,半定量RT-PCR检测DC的iNOS、APRIL及BAFF表达。5.NO检测:收集处理12h、24h、36h、48h、及72h的各组DC培养上清,用Griess试剂法检测培养上清NO浓度。6.IL-23测定:收集处理3天的DC培养上清,用ELISA检测培养上清IL-23浓度。结果1.RA联合IL-5抑制C57BL/6脾脏来源的DC表达CD80;RA联合IL-5和/或IL-6增强DC细胞系MHC-Ⅱ类分子及CD54的表达,但不影响其MHC-Ⅰ类分子及CD86的表达。2.RA联合IL-5和/或IL-6增强DC刺激同种异型T淋巴细胞增殖的能力。3.RA或RA联合IL-5和/或IL-6促进DCAPRIL基因的表达。4.IL-6显著促进了DC iNOS基因的表达及NO的分泌。5.RA联合IL-5和/或IL-6不影响DC BAFF的表达及IL-23的分泌。结论RA联合IL-5和/或IL-6促进DC细胞系APRIL基因的表达;IL-6显著促进了DC细胞系iNOS基因的表达及NO的分泌。这些实验结果可为进一步研究在DC存在时,RA联合IL-5和/或IL-6增强B细胞IgA类型转换,促进IgA分泌的分子机制打下了基础。