Saccharomyces cerevisiae是GRAS（Generally Regarded As Safe）微生物,因其具有较好的耐受性、易培养的遗传特性,在生物行业被作为“细胞工厂”而被广泛应用。尽管在酿酒酵母中常采用高拷贝2u质粒等作为遗传操作工具,但是往往因为不稳定,易丢失等问题而被相关人员所诟病,而采用在基因组上整合表达的方式导入外源基因,一般拷贝数都不高,理论上也无法实现外源基因的高效表达。因此,在基因组中多拷贝整合基因技术逐渐成为研究的热点。Ty系列是属于反转录转座子的一个子类,它们通过复制-粘贴机制以RNA为中间物进行转座,转座的结果使酵母基因组中出现了很多数量的Ty拷贝,在酿酒酵母基因组中共发现了三百多个Ty插入位点,借助LTR（Long terminal repeat）序列可以同源重组整合基因打靶片段,实现基因的多拷贝植入。本论文通过TY家族,借助基因编辑技术,建立了酿酒酵母TY4多拷贝基因植入系统,并以外源基因gfp和内源基因haa1为指征,验证了TY4多拷贝系统的稳定性和可重复性。研究结果如下:1、构建了TY4多拷贝系统。利用Overlapping PCR技术、Gibson组装技术、酶切连接技术等分子操作将基因片段进行组装,构建包括LTR上下游片段的TY4工具质粒。工具质粒的构成依次包括以下几个部分:LTR上游同源片段、带有限制性内切酶识别位点的外源基因插入位点、5’和3’端带有Cre重组酶识别位点的URA筛选标记表达盒和LTR下游同源片段。为了提高基因整合效率和拷贝数,构建了TY4的LTR位点切割sg RNA转录单元的辅助质粒SGTY4PESCG-LEU和Cas9-TRP双质粒配件以及TY4的LTR位点切割的Cas9-SGTY4-TRP单质粒配件。2、利用TY4外源基因GFP验证了多拷贝系统的可行性。将TEF启动子、gfp基因和CPS1TT终止子组件融合搭接、组装在带有LTR上下游片段的工具质粒上;以构建成功的质粒GFPTY4URAPMD18为模板进行PCR,获得同源打靶片段,进行PEG/Li Ac转化;对得到的抗性菌株进行分子验证;将得到的不同阳性转化子进行培养,利用蓝光透射仪器、荧光倒置显微镜,初步定性检测各自转化子的荧光强度;利用Bio Tek酶标仪定量检测荧光强度,数据如下:野生型菌株WT为21815;GFP单拷贝菌株为28560;转入质粒α-GFPPRS424TRP菌株为83471;无Cas9介导GFPTY4多拷贝菌株为27331;Cas9介导双质粒系统GFPTY4多拷贝菌株为51272;Cas9介导单质粒系统GFPTY4多拷贝菌株（1）为42560;Cas9介导单质粒系统GFPTY4多拷贝菌株（2）为90326;Cas9介导单质粒系统GFPTY4多拷贝菌株（3）为59100。实验结果表明:GFPTY4多拷贝菌株的荧光强度都高于野生型,说明gfp在酿酒酵母中表达;无Cas9介导的GFPTY4多拷贝菌株只与单拷贝菌株荧光强度相当;质粒表达的α-GFPPRS424TRP的菌株和Cas9介导单质粒系统GFPTY4多拷贝菌株（2）的荧光强度值明显高于其他菌株;CRISPR介导的菌株中单质粒和双质粒区别不大;荧光强度的多少与GFP基因的拷贝数相关的,CRISPR介导有利于外源基因的多拷贝植入。并通过软件MATLAB将图片信息转换成数字结果。结果表明:利用质粒进行gfp基因整合的菌株,其灰度值（亮度单位）是86;而TY4多拷贝系统进行整合的菌株灰度值几乎都能超过一百,个别菌株更是高达150。3、以haa1基因的植入验证了TY4系统的稳定性和可重复使用的特点。将TEF启动子、haa1基因和CPS1TT终止子组件融合搭接、组装在带有LTR上下游片段的工具质粒上;以构建成功的质粒HAA1TY4URAPMD18为模板进行PCR,获得同源打靶片段,进行PEG/Li Ac转化。TY4系统设计了利用Cre/Loxp重组机制实现URA筛选标记的重复使用。将上述实验得到的HAA1的阳性转化子,转化Cre表达质粒,经过三代无URA的培养基的液体培养,涂布获得单克隆,挑取单克隆在有URA和无URA的培养基中影印培养,获得URA重新缺失菌株,经PCR验证,haa1基因依然存在,说明多拷贝系统外源基因植入的稳定性较好;同时URA筛选标记的回复,可以使该系统继续应用于其他基因的多拷贝植入,实现其可重复性。