研究背景:　　 大肠癌(colorectAlcarcinoma, CRC)是发病率居世界第三的常见恶性肿瘤。中国每年新增大肠癌患者40万，死亡率为7.35/10万。手术及放化疗是CRC的传统治疗手段，虽然能抑制肿瘤生长，但疗效有限，导致临床疗效出现瓶颈。血管生成是CRC生长、侵袭、转移的关键因素之一，而血管内皮生长因子(vascular endotheliAlgrowthfactor，VEGF)是CRC 血管生成中的关键因子，和患者的不良预后相关。标准化疗方案中加入抗VEGF 药物，如贝伐单抗，可明显改善转移性CRC患者的预后，但效果有限。除VEGF 外，还有一些未知的促CRC 血管生成因子有待探索，这些因子的发现及鉴定将为新的抗血管生成方案的制定奠定基础。　　 炎症是恶性肿瘤的七大特征之一，与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现，肿瘤微环境中的促炎症因子，如白介素6(Interleukin 6，IL-6)、IL-1β，肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α, TNF-α)和IL-8 可诱发炎症，趋化炎症细胞(如T细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞等)分泌细胞因子刺激肿瘤增殖，诱导免疫耐受，并分泌VEGF等促血管生成因子参与肿瘤血管生成。IL-17是一种新发现的促炎症细胞因子，主要由活化的CD4+T辅助细胞，即Th17细胞产生，巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和CD8+T细胞也可少量分泌。IL-17 阳性细胞在炎症相关性肿瘤，如胃癌、肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中均高表达。在移植瘤模型中，转染了IL-17的肿瘤生长变快，而且血管生成增加。目前，关于CRC中IL-17的细胞来源、IL-17与CRC 临床病理特征的相关性、IL-17在CRC 发生发展中的作用仍有待进一步研究。由于IL-17可促进多种靶细胞分泌IL-6、IL-8和VEGF等细胞因子，同时人肺腺癌细胞株，骨肉瘤细胞株均表达IL-17 受体(IL-17 receptor，IL-17R)，故我们推测CRC细胞也表达IL-17R，而IL-17 可以通过促进CRC细胞分泌VEGF等促血管生成因子，并作用于血管内皮，进而促进肿瘤血管生成。　　 目的:　　 明确IL-17对CRC 预后和血管生成的影响，探讨IL-17 促进血管生成的可能分子机制，为寻找抗肿瘤血管生成靶点提供新的依据。　　 方法:　　 1．通过免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察IL-17与CD4(T 辅助细胞表面标志)、IL-17与CD68(巨噬细胞表面标志)的共表达，以鉴定IL-17的细胞来源。　　 2．免疫组织化学法检测IL-17蛋白在52例III 期CRC组织中的表达，并分析IL-17表达与肿瘤临床病理特征、预后的关系。Kaplan-Meier 法(log-rank 检验)分析IL-17 阳性、阴性表达组中生存率的差异，单因素和多因素COX 风险回归模型分析多个因素对患者预后的影响。　　 3．免疫组织化学法检测52例CRC组织中CD31的表达，t 检验分析MVD与IL-17表达的关系。　　 4．流式细胞术、RT-PCR 检测SW480, HCT116, HT-29, LoVo和 LS174T等5种CRC细胞株中IL-17R的表达，并进一步以表达IL-17R的LoVo细胞株为主要体外模型，PCR-array 筛选IL-17 刺激LoVo后表达上调的促血管生成相关因子。　　 5．定量RT-PCR和ELISA 法检测IL-17 刺激4种CRC细胞株后 VEGF的表达改变。免疫组织化学法检测VEGF在52例CRC组织中的表达，卡方检验分析CRC组织中IL-17与VEGF 之间的相关性，t 检验分析CRC组织中MVD与VEGF表达的关系。　　 结果:　　 1．激光共聚焦显微镜观察CD4、CD68与IL-17免疫荧光染色，发现CD4与IL-17、CD68与IL-17 共表达于肿瘤间质，表明大肠癌中IL-17 来源于CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞。　　 2．52例III 期CRC组织切片进行免疫组化染色，发现有26例高表达IL-17。大部分的IL-17 阳性细胞表现出典型的T细胞和巨噬细胞形态特征。IL-17在远癌正常组织，腺瘤，癌旁和癌内组织均表达，但以癌旁，特别是癌内最为明显。分析IL-17与临床病理特征的关系，我们发现：IL-17表达与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度和病理类型无关。K-M 法分析发现，IL-17表达与患者不良预后相关，IL-17 阴性表达患者5年生存率为72.41％，而IL-17 阳性表达患者为38.08％，两者有统计学差异（p=0.002)，IL-17 阳性表达患者有相对较短的总生存期(overall survival，OS)。单因素和多因素分析显示，肿瘤内的IL-17的表达为OS的独立预后因子。　　 3．免疫组化检测52例CRC 石蜡切片内CD31与IL-17表达的关系，发现IL-17阳性表达患者的MVD(91.54±30.48)高于IL-17 阴性表达患者(66.35±32.82)(P=0.006)。　　 4．LoVo、LS174T、HCT-116、SW480、HT-29 均表达IL-17R，PCR 芯片筛选IL-17 刺激LoVo后表达上调的促血管生成因子，发现外源性IL-17 可显著上调VEGF， 尿激酶纤溶酶原活化因子(plasminogen activator urokinase，PLAU)，神经纤毛蛋白(neuropilin 2，NRP2)，金属基质蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9)，IL-6和DNA 结合抑制因子3(inhibitor of DNA binding 3，ID3)等促血管生成相关因子的表达。　　 5．LoVo、LS174T、HCT-116、HT-29 经用不同浓度的IL-17作用6 h后, VEGF mRNA表达呈剂量依赖性增加,在IL-17浓度为10，50，100ng/ml时与对照组之间的差异均有统计学意义，在IL-17浓度为100ng/ml时达到峰值，为对照组的4.20±0.71、2.90±0.47、3.82±0.43、3.65±0.62倍 (P＜0.01)。以上细胞用100ng/ml的IL-17作用48 h，ELISA检测VEGF蛋白表达量与对照组之间的差异有统计学意义(1009.3±45.5vs401.6±37.4,900.5±23.4vs298.1±14.3, 712.2±25.4vs365.3±30.5, 575.8±62.7vs260.5±23.2, P<0.01)。免疫组化检测52例CRC 石蜡切片内IL-17与VEGF表达的关系，MVD与VEGF表达的关系，发现IL-17表达与VEGF的表达具有相关性（P＜0.01)。VEGF 阳性表达患者的MVD(86.74±33.24)高于VEGF 阴性表达患者(67.43±32.09)（P＜0.05)。　　 结论:　　 1．人CRC组织中，IL-17 主要来源于肿瘤间质的CD4+T细胞和巨噬细胞，IL-17在人CRC组织内高表达，与不良预后显著相关，是独立的预后预测因子。　　 2．人CRC组织中，IL-17表达与MVD 相关，提示IL-17 可能通过促进肿瘤的血管生成而发挥促肿瘤效应。　　 3．IL-17R表达于多种人CRC细胞系，体外实验证实IL-17 可以上调LoVo细胞株VEGF，PLAU，NRP2，MMP9，IL-6和ID3等促血管生成相关因子的表达。　　 4．IL-17在人CRC组织中的表达与VEGF 相关，IL-17 可以上调CRC细胞株VEGF的表达，IL-17 可能通过促进CRC细胞分泌VEGF 而促进肿瘤的血管生成。