少孢节丛孢中生物合成相关基因的功能及嗜热踝节菌突变菌株构建的研究

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少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)作为模式捕食线虫真菌可以通过产生三维菌网捕捉并杀死线虫,本论文初步研究了细胞色素P450基因AOLs00215g21及4个次生代谢产物调控因子AOLs00043g51,AOL s00054g811,AOLs00076g605,AOLs00215g535的生物功能。通过运用生物信息学分析,在少孢节丛孢全基因组中筛选出5个候选基因,分别是细胞色素P450基因AOLs00215g21,表观遗传调控因子AOLs00043g51及AOLs00076g605,全局调控因子AOLs00054g811,信号转导通路调控因子AOLs00215g535。运用In-Fusion的方法构建敲除载体,CaCl2/PEG介导的原生质体转化方式敲除这5个基因。通过潮霉素筛选验证得到阳性转化子,通过对其表型、生测和代谢图谱实验探究这5个基因的功能。发现与野生菌株相比,突变菌株△AOLs00215g21和△AOLs00043g51菌丝生长速率明显提高,△AOLs00215g21的孢子及捕器产量也均有所提高。突变菌株△AOLs00054g811,△AOLs00076g605,△AOLs00215g535生长速率,孢子产量与野生型菌株相比均显著降低,其中△AOLs00215g535捕器产量虽少于野生型菌株,但在24h时比野生型菌株提高了130%;同时这3株突变菌株的HPLC及GC-MS图谱显示其代谢图谱中的峰与野生型菌株相比均减少了很多,但是仍旧有特异峰出现。其中△AOLs00215g535的HPLC图谱显示突变菌株多出8个特异峰,减少了 20个在野生型菌株中出现的峰;GC-MS图谱显示突变菌株多出23个特异峰,减少了 5个在野生型菌株中出现的峰。以上可看出敲除这5个基因对少孢节丛孢的菌丝形态,生长速率,孢子产量,孢子萌发率,捕器生成,捕食线虫能力及次生代谢产物合成均有一定的影响,其中△AOLs00215g535的变化最大。本论文还开展了对高温真菌嗜热踝节菌(Thermomyces dupontii2155)中突变菌株构建的初步研究。嗜热踝节菌中能产生一类PKS/NRPS杂合生源大环内脂类化合物高温菌素(Thermolides),对多种病原线虫都有极强的抑制作用。本论文利用不同的遗传转化手段对嗜热踝节菌中突变菌株的构建进行了初步研究。通过运用生物信息学分析,在嗜热踝节菌2155全基因组中筛选出9个候选基因,包括双链断裂修复酶(Ku70)基因Talth006364t1,双键还原酶(ER)基因Talth004946t1,3个萜类化合物合成酶(TPS)基因Talth002743t1,Talth0037795t1,Talth006604t1,4个Ⅰ型聚酮类化合物合成酶(PKS)基因Talth002859t1,Talth004008t1,Talth006479t1,Talth006666t 1。通过农杆菌介导转化,潮霉素做筛选标记得到两株突变菌株:△Talth006364t1及△Talth004946t1,而其它7个基因始终未获得阳性转化子。即使更换诺尔斯菌素作为抗性筛选标记及使用电转化方法也未成功。因此推测嗜热踝节菌的自我修复机制过强,且所用转化方式不够准确有效,今后应寻找打靶率更高,错配率更低的转化方式来构建嗜热踝节菌突变菌株。本文对5个少孢节丛孢生物合成基因的功能进行了初步鉴定,其中突变菌株△AOLs00215g535与野生菌株差异最为显著。此外利用农杆菌转化及电转化技术,潮霉素及诺尔斯菌素作为抗性筛选标记对嗜热踝节菌突变菌株的构建进行了初步探究,为以后研究高温真菌中的生物合成基因奠定基础。
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