论文部分内容阅读
适宜的开花时间对于植物的生殖生长及其产品器官的产量和品质非常重要,因此植物进化出复杂且精细的调控机制来调控开花时间。芥菜(Brassica juncea Coss)是十字花科芸薹属蔬菜,起源于亚洲,在我国南方大面积种植。因此,芥菜开花时间基因调控网络的研究,对于生产指导和科学研究都有非常重要的意义。近30年对模式植物拟南芥基因的研究表明开花遗传调控网络由6个途径相互作用调控：光周期途径,自主途径,春花途径,赤霉素途径,环境温度途径,年龄途径。这六个途径主要由一些开花整合子基因调控,这些基因编码不同的蛋白,通过整合多个途径中的信号从而调控开花时间,例如开花信号整合子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1),它能够整合低温春化途径核心调控因子FLOWERING LOCUS C (FLC和光周期途径核心调节因子SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)的开花信号。但是,芥菜SOCl基因是否受到FLC和SVP蛋白的转录调控?FLC和SVP蛋白能否直接结合到SOCl基因启动子上抑制SOCl基因的表达?目前并不清楚。本试验以芥菜为研究材料,根据SOCl已知基因序列设计特异性引物,利用染色体步移法克隆出SOCl的启动子,并且利用生物信息学分析启动子的关键调控元件。构建SOCl启动子及SVP、FLC的酵母单杂交重组表达载体,通过酵母单杂交系统进一步鉴定及分析SOCl启动子与SVP、FLC蛋白相互作用,以期为SOC1基因的转录调控等深入研究奠定基础。1、SOC1启动子的克隆及生物信息学分析提取芥菜基因组DNA,根据芥菜SOC1已知基因序列设计特异性引物,利用染色体步移法从芥菜gDNA中克隆出未知SOCl启动子序列。获得的SOC1启动子为782bp,进化分析表明芥菜SOCl的启动子与拟南芥SOCl的启动子关系最近,与高山南芥SOCl的启动子亲缘关系最远。对其顺式元件生物信息学分析发现,该序列中含有TATA-box核心启动子元件、CAAT-box等上游启动子元件以及多种应答元件。2、SOC1的启动子克隆与FLC、SVP蛋白相互作用的检测设计带有HindⅢXhoⅠ酶切位点的引物,亚克隆SOC1的启动子基因序列。构建SOC1启动子、SVP. FLC的酵母表达载体pAbAi-SOC1、pGADT7-FLC、 pGADT7-SVP。利用酵母转化系统操作手册将线性化的酵母重组质粒pAbAi-SOC1转化到酵母感受态细胞中,得到相应的酵母转化子YIH (pAbAi-SOC1)。SD/-Ura平板上30℃倒置培养3-5d,发现酵母转化子能够正常生长,表明线性化pAbAi-SOC1重组质粒已成功导入酵母基因组中。进一步在SD/-Ura/AbA*缺陷培养基上筛选AbA抗性浓度,结果表明AbA100ng/ml下,假阳性就能够很好地被抑制。然后进行二次转化,将pGADT7-FLC、pGADT7-SVP重组质粒转化到Y1H(pAbAi-SOC1)酵母感受态细胞中,发现YIH (pAbAi-SOC1×pGADT7-FLC)、YIH (pAbAi-SOC1 ×pGADT7-SVP)都能在SD/-Leu/AbA100上正常生长,结果说明克隆得到的芥菜SOCl启动子能够与FLC、SVP蛋白发生相互作用,为进一步研究它们的作用位点提供了基础。3、SOC1启动子与FLC、SVP蛋白相互作用关键区域的预测在拟南芥的研究中发现,MADS-box蛋白会特异性结合到CArG-box (MADS蛋白结合元件)上,从而激活或抑制下游基因的表达。SVP、FLC蛋白属于MIKC型MADS-box蛋白,因此我们分析了SOC1启动子序列,并没有发现与拟南芥SOC1启动子中序列完全一致的CArG-box,但是找到了三个类似的CArG-box,并推测这三个位点可能是SOC1基因的启动子与SVP、FLC蛋白的相互作用位点。