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肝癌是高致死率的恶性肿瘤之一,在中国其发病人数占全球总数的55%。肝癌细胞相比于正常细胞发生很多变化,DNA甲基化的改变是其中之一。DNA甲基化修饰反应主要由DNA甲基转移酶(DNA (cytosine-5)-methyltransferases, DNMTs)催化。目前公认的人类具有催化活性的DNMT有三种:DNMT1, DNMT3A和DNMT3B,其编码基因分别位于染色体19p13.2.、2p23和20q11.2。DNMT1以半甲基化状态存在的DNA双链作为催化底物而具有维持性甲基化酶的作用。而DNMT3A和DNMT3B是从头(de novo) DNA甲基化修饰所必须的,主要为在细胞内建立新DNA甲基化类型。肿瘤细胞中存在异常的甲基化修饰,即基因组DNA低甲基化与某些基因启动子高甲基化。这种表观遗传学的改变与肿瘤细胞发生发展密切相关。星形孢菌素(staurosporine, STS)能够抑制多种蛋白酶并能够抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,其诱导凋亡的机制主要是通过线粒体途径。STS诱导细胞凋亡过程中DNMT是否参与及其作用是什么目前研究甚少,我们以此为出发点进行了本课题的研究。在本文第一部分实验中,我们观察了STS诱导的人肝癌细胞凋亡与DNMT3B的变化之间的相关性。首先我们选用一系列不同浓度观察STS对肝癌细胞增殖能力的影响。结果发现STS可诱导人肝癌细胞增殖能力下降,并具有浓度依赖性。同时在蛋白质水平观察PARP和胱天蛋白酶(caspase-3)的剪切,证明STS能够诱导凋亡,这种效应也具有浓度依赖性。在此基础上我们选用了对两种细胞抑制率都在50%左右以及细胞凋亡现象比较明显的STS浓度1μ M进行后续的实验。用1μM STS作用细胞0h、4h、12h后用DAPI作凋亡小体染色及用流式细胞仪测定细胞凋亡情况,结果发现随着时间的延长凋亡小体增多,细胞的总凋亡比例也随时间延长而增加。此结果说明STS诱导的两种人肝癌细胞凋亡具有时间依赖性。然后我们想要了解DNMT1和DNMT3B在细胞凋亡发生过程中是如何变化的。我们观察了STS的时间梯度与效应的关系,发现在两株人肝癌细胞中DNMT1蛋白质没有明显地变化,而DNMT3B蛋白质随STS作用时间延长而减少。然后我们针对DNMT3B测定了mRNA水平、蛋白质稳定性、mRNA稳定性以探讨STS下调DNMT3B的表达发生在何种水平。结果发现DNMT3B mRNA的水平随着时间推移逐渐下降,蛋白质稳定性也受到影响,而mRNA稳定性没有显著差异。这些结果提示STS能够在蛋白质降解水平和mRNA水平上调控DNMT3B表达。第二部分我们深入STS在转录水平调控DNMT3B可能的分子机制和DNMT3B变化是否参与了STS诱导的细胞凋亡及其可能的机制。用构建的DNMT3B核心启动子片段转染细胞然后用STS处理,发现STS降低了DNMT3B基因核心启动子的活性。接着我们研究STS是如何调控DNMT3B表达。研究中发现p-JNK激活而其它的MAPK途径是逐渐减弱的,因此我们设想JNK途径可能参与了STS对DNMT3B的调控。用p-JNK抑制剂处理细胞后发现能够减轻STS对DNMT3B蛋白质水平的下调。这些结果说明STS可能是通过JNK途径调节DNMT3B蛋白质的表达。然后我们研究DNMT3B的减少在STS诱导的细胞凋亡中的作用。我们设计了DNMT3B的小干扰RNA (siRNA)并转染了BEL-7404细胞。首先证明了siRNA能有效干扰DNMT3B。我们在mRNA水平进行了检测,证实其能够下调DNMT3B mRNA的表达。我们进一步想了解DNMT3B的下调是否能够促进STS诱导的肝癌细胞凋亡。在干扰DNMT3B48小时后加入STS作用4小时,发现比单纯用STS作用于细胞能够显著地增强PARP的剪切和胱天蛋白酶-3的剪切,即能够显著地增强细胞对STS这种药物的敏感性,促进了其诱导的细胞凋亡作用。接着我们进一步探讨了DNMT3B促进STS诱导细胞凋亡的机制。在干扰DNMT3B表达后我们发现抑癌基因p16的表达上调,认为这可能是DNMT3B表达下降促进细胞凋亡的关键。综上所述,我们发现在STS诱导的肝癌细胞凋亡中DNMT3B蛋白质和mRNA水平下调是蛋白质的稳定性和转录活性受到影响所致。JNK途径参与了STS诱导的DNMT3B蛋白质表达的变化。而DNMT3B基因表达下调促进了STS诱导的人肝癌细胞凋亡。本文阐明了DNMT3B基因表达在STS诱导细胞凋亡中的作用及其分子机制,对于深入研究表观遗传学水平调控在肿瘤细胞凋亡中的作用具有一定的理论意义和临床意义。