重组血管活性肠肽克隆构建及其生物活性测定

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血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)具有多种生物学功能,包括对胃肠道的刺激作用、神经肽作用、免疫作用,以及对心血管系统的作用和影响肿瘤生长的作用。但是,VIP在体内降解很快、半衰期小于1分钟,这使VIP在应用上受到了极大的限制。迄今为止用于提高VIP在体内半衰期的方法都不能令人满意,急需找到一种经济、有效且安全的方法延长VIP在体内的半衰期。HSA作为载体蛋白可以有效地延长小分子蛋白在血液中的半衰期。本论文以实验室已有的带有HSA的质粒pcDNA3.1-HSA为模板扩增得到HSA,将全合成的VIP片段与HSA相连接,构建于载体pcDNA3.1上,得到的VIP重组蛋白表达载体pcDNA3.1-HSA-VIP,将其转化入TOP10感受态后送测序,经测序完全正确。将带有表达载体的菌扩大培养后对其进行质粒DNA的大量提取,将其转染CHO细胞表达,收集细胞上清得到目的重组蛋白。VIP具有抗炎活性,可以显著下调由LPS诱导的急性炎症状态下产生的促炎因子血清抵抗素的水平,本文依据此原理检测了 VIP重组蛋白的生物学活性。使用小鼠血清抵抗素ELISA试剂盒对各实验组小鼠血清中的抵抗素水平进行检测,实验结果显示样品VIP+LPS 组浓度 0.04 μg/L,这明显低于 LPS 50 μg/g 组(1.40 μg/L)和 LPS 5 μg/g 组(1.53μg/L),可能是VIP对LPS的作用起到了逆转所致。但是,生理盐水组抵抗素浓度为3.17μg/L,远低于文献报道的正常值。测得值与文献中报道不符,经验证是试剂盒灵敏度低所致。进一步的研究还在进行中。此外,本文对小鼠的行为学观察结果表明VIP重组蛋白具有一定的生物学活性。
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