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γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物脑中主要的神经递质之一,它能够调节多种生理过程。它通过离子型的GABAA受体介导快速的神经抑制效应,通过突触前和突触后的GABAB受体介导缓慢的、持续性的抑制效应。其中GABAB受体是一种G蛋白偶联受体,由GABAB1和GABAB2两个亚基组成。它在神经中枢系统中分布非常广泛,是治疗癫痫、疼痛、药物成瘾、焦虑和抑郁等神经性疾病的药物靶点。 在本研究中,我们研究了小鼠小脑颗粒神经元(CGNs)中GABAB受体介导Rap1激活的信号通路。我们用GABAB受体的特异性激动剂 Baclofen刺激 CGNs,发现GABAB受体的激活能够持续性的激活小G蛋白Rap1。我们还发现GABAB受体介导Rap1的激活过程是Ca2+依赖的,但是胞内的Ca2+浓度并没有发生改变。胞内cAMP水平的升高也能够激活Rap1,而且这一激活过程并不涉及PKA。但是GABAB受体的激活并不能引起CGNs中cAMP水平的改变,所以cAMP并不参与CGNs中GABAB受体介导Rap1的激活。另外,我们还研究发现能够作为Rap1GEF的PLCε不参与GABAB受体介导 Rap1的激活。总之,本研究是以 CGNs为研究对象,对 GABAB受体介导Rap1激活机制进行了初步的研究。其结果为GABAB受体介导的Rap1信号通路的精细转导机制的阐明、相关的生理功能的探究以及以GABAB受体为靶点的药物筛选与开发提供了一定的基础。 为了进一步展开研究CGNs中GABAB受体激活对内源性Ras蛋白的影响,我们通过质粒构建、蛋白纯化、GST-pulldown检测纯化出了能够有效分离 RasGTP的活性探针GST-Raf1-RBD。此蛋白可以作为探针从纯化的样本或细胞裂解物中特异的分离出RasGTP,然后再经Ras的抗体检测分离出的RasGTP,即可检测出胞内Ras的活化水平。这为下一步研究GABAB受体激活对内源性Ras的影响以及其他Ras信号通路的研究提供了有效的技术手段。