2003年的SARS给全世界带来极大恐慌，其流行主要通过隔离等传统的传染病控制措施得到了控制，但是其传染源、致病机理等问题仍未明确，有待进一步深入研究。自1997人类感染禽流感以来，H5N1型禽流感对人类健康也构成了极大的威胁。这两种呼吸道病毒的多聚酶基因在病毒的转录、复制及跨越物种等方面都有重要的作用，本论文结合目前SARS．CoV和：H5N1型禽流感的最新研究进展开展了SARS-CoV和H5N1禽流感病毒多聚酶基因的分子进化研究。 研究目的 1．克隆表达SARS-CoV多聚酶基因nsp2和nsp5，预测其结构、功能并分析其变异特点，为设计抗SARS药物奠定基础。 2．分析SARS-CoV多聚酶基因nsp2、nsp5和H5N1禽流感病毒多聚酶基因PA、：PB1、PB2遗传变异特征和趋势，为SARS-CoV和H5N1禽流感流行的防治提供科学依据。 研究方法 1．分离培养SARS-CoV，提取病毒RNA，RT-PCR扩增nsp2和nsp5基因。 2．nsp2和nsp5 PCR产物分别与真核表达载体pCI-neo连接构建重组质粒。 3．重组质粒在COS-7细胞中表达蛋白并用SDS-PAGE进行鉴定。 4．测序后与Genbank中的其他SARS-CoV毒株nsp2和：nsp5基因进行了比对，分析了其变异规律。 5．用PSIPRED和GOR软件预测nsp2和nsp5蛋白的二级结构，用3D-PSSM软件预测nsp2和nsp5基因的三级结构和功能。 6．在Genbank中搜索筛选来自中国不同地区和年代的H5N1病毒PA，PB1，PB2基因序列。用Clustal-W、Bio-edit、Treeview、DNAclub、Primer Premier 5.0等生物信息学软件包对PA、PB1、PB2基因序列和氨基酸进行比对、编辑、进化分析。 研究结果 1．成功克隆并表达了SARS-CoV nsp2和nsp5蛋白。 2．GD株nsp2基因和NCBI中100株SARS-CoV毒株nsp2基因完全一致，只有5株在共5个位点(45，178，184，339，603)出现了7个单核苷酸变异(single nucleotidevariations，SNVs)。其中5个SNVs引起了无义突变(BJ01，GD01和GZ02株)，另2个SNVs引起了有义突变(Sinol-11和GZ-C株)，并导致二级结构的变化。110株SARS-CoV病毒的nsp5基因，只在5个位点发生了5个基因突变，2个氨基酸变异，没有二级结构的变化。 3．二级结构结果显示GD株nsp5蛋白主要由α螺旋组成。三级结构结果表明和GD株nsp5蛋白相似性最高的三种蛋白是酿酒酵母钙调节蛋白、三磷腺苷δ亚单位、肌钙蛋白；和GD株nsp2蛋白同源性最高的三种蛋白为SARS urbani株3CL，传染性胃肠炎病毒3CL(41﹪)。 4．39株H5N1禽流感毒株PA蛋白共137个位点发生变异，形成稳定变异的位点为63位(I→V)、201位(V→I)、212位(C→R)、228位(K→N)、361位(R→K)、399位(K→E)、504位(L→I)、536位(R→K)、544位(R→E)、553位(E→A)、585位(P→L)、586位(F→L)。39株H5N1禽流感毒株PB1蛋白共127个位点发生变异，完全发生变异的有134位(K→N)、460位(E→Q)、478位(T→S)、490位(C→F)、535位(M→I)、536位(D→N)、558位(P→T)、598位(P→L)。 39株H5N1禽流感毒株PB2蛋白共135个位点发生变异，发生大范围变异的是334位、355位、471位、508位、579位、590位、627位、698位、727位、741位(F→S)。 5．成功构建了PA、PB1、PB2系统进化树，结果显示国内H5N1禽流感毒株的遗传演化分布较为复杂，从时间上来看不是简单推移关系；在地域上，尽管PB1简单的呈现华北、华南、东北地区分布，但是很多来自同一省份的毒株在进化树上错综分布。 结论 1．Nsp2和nsp5蛋白在在传播和进化过程中是相对稳定的，比较适合做为抗SARS药物靶点。但是发生的变异可能对适应宿主非常重要，其中的机制有待进一步研究。 2．Nsp2蛋白具有3CL功能，nsp5蛋白可能有和钙调节蛋白相似的功能。 3．H5N1型禽流感病毒极易发生变异，1997和2003年的香港人禽流感的爆发和大陆地区禽流感的流行没有直接关系。 4．中国来自不同地域的H5N1毒株可能有不同的起源；H5N1型禽流感若要获得感染人的能力需要发生较大范围的基因重组；即使多聚酶基因也是来自不同毒株的重组体；感染人类的H5N1禽流感病毒的多聚酶基因和其他禽类来源的禽流感毒株在进化上有较大的差异，H5N1型禽流感病毒在获得感染人的能力的时候已经发生了重组。