代谢工程可用多基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行改造,实现构建新的代谢途径并生产特定目的产物。本论文采用代谢工程方法分别在大肠杆菌和酪丁酸梭菌构建了苯乳酸和正丁醇合成途径,并采用不同的发酵工艺生产目的产物。1.苯乳酸(2-hydroxy-3-phenylpropanonic,PLA)天然存在于蜂蜜与发酵食品中,可广泛抑制导致食品腐败变质的一些细菌和真菌。乳酸菌可利用苯丙氨酸或酪氨酸合成PLA,但是效率较低。因此,异源生物合成PLA效率的研究具有重要意义。(1)以在大肠杆菌构建PLA合成途径为目的,首先对一个新型的可以转化L-苯丙氨酸生产苯乳酸的前体物质苯丙酮酸的氨基酸氧化酶进行了克隆表达研究。以灰盖鬼伞蘑菇(Coprinus cinereus)基因组为模板,经PCR扩增得到长度为2334 bp的片段。将扩增得到的编码L-苯丙氨酸氧化酶(CC-LPOX)的DNA片段连接到pET28a+载体,转化大肠杆菌进行异源表达、纯化,并进行性质测定。通过blastx比对分析发现,其编码的氨基酸序列与黏滑菇(Hebelomacylindrosporum)来源氨基酸氧化酶序列同源性最高,为30.6%。纯化后的蛋白质经过SDS-PAGE测定分子量为87.1 kDa,凝胶过滤测定分子量为191.1 kDa,该酶最适温度为45℃,最适pH 8.5,最适底物为L-苯丙氨酸,比活力为6.04 U/mg,同时对L-酪氨酸和L-组氨酸也具有活性。该酶可以高效催化L-苯丙氨酸生产苯丙酮酸,在最适条件下12 h内可将8.0 g/L L-苯丙氨酸几乎全部转化为苯丙酮酸,转化率为97.4%,产率为1.02 g/L·h。苯丙酮酸作为苯乳酸的前体物质,可进一步被用来生产苯乳酸。(2)将CC-LPOX和来源于植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因LDH共同连接在质粒pETDuet-1中,在大肠杆菌内构建人工合成苯乳酸合成途径,使得到的菌株E.coli(ldh-lpox)可以转化L-苯丙氨酸生产苯乳酸。采取了两种不同的实验方案进行转化实验,全细胞高密度转化方案:在最优条件下,可生成9.76 mM苯乳酸;全细胞不同温度两阶段发酵方案:在最优条件下,可生成8.85 mM苯乳酸。2.正丁醇是一种极具潜力的生物燃料,在正丁醇发酵过程中,底物成本占总生产成本的一半以上,较高的底物成本限制了正丁醇发酵工业的发展,因此,发掘新型菌株,利用价格更低廉的农业废弃物进行发酵生产正丁醇可更进一步提高其竞争力。(1)将来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的三个蔗糖代谢相关基因,包括蔗糖转运蛋白基因、蔗糖酶基因和果糖激酶基因,以及一个双功能乙醛/乙醇脱氢酶基因导入一株已经敲除掉乙酸激酶基因(acetate kinase,ack)的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum(△ack))中,使其可以利用蔗糖为唯一碳源发酵生产正丁醇。在发酵罐中,得到的基因改造菌株Ct(△ack)-pscrBAK分别以蔗糖或糖蜜为碳源可生产14.8-18.8 g/L正丁醇,且正丁醇占培养基中所有有机溶剂的比例高达0.94(w/w)。当培养基中不添加抗生素而是以蔗糖为基因改造菌株的天然筛选压力时,正丁醇得率达到0.25 g/g,产率达到0.28 g/L·h。在以糖蜜为碳源时,该菌株不受培养基中葡糖糖引起的碳代谢阻遏的抑制作用,可同时利用培养基中的葡萄糖、蔗糖和果糖进行生长发酵。(2)使用价格更加低廉的玉米浆作为有机氮源替代原CGM培养基中的胰蛋白胨和酵母浸粉,Ct(Aack)-pscrBAK以蔗糖为碳源时,可生产16.0 g1L正丁醇,得率为0.31 g1g,产率为0.33 g/L·h;以糖蜜为碳源时,可生产15.0 g/L正丁醇,得率为0.24 g/g,产率为0.30 g/L·h。将该菌株细胞固定在纤维床上进行重复批次发酵,在以蔗糖为碳源时,正丁醇得率稳定在0.22 g1g,产率为0.47 g/L·h;以糖蜜为碳源时,正丁醇得率稳定在0.21 g/g,产率为0.53 g/L·h。