莱茵衣藻高产油脂藻株的诱变筛选及其油脂代谢关键酶基因的转录分析

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面对日益枯竭的化石能源和严重恶化的生态环境,生物柴油作为一种新型可再生的清洁能源,引起世界各国的关注。微藻能进行光合作用,生长速度快、油脂含量高、且培养占用耕地,被认为是最具潜力的油脂生物能源。但是生产成本较高,微藻能源至今未突破产业化这个瓶颈。本研究旨在通过诱变选育的方法获得生长速度快且油脂含量高的微藻,并对其油脂代谢关键酶基因进行转录分析,探究其油脂含量增加的可能原因和途径,以期为微藻生物柴油高产油脂藻种的选育及在生产实践中应用基因工程手段进行藻株的改造提供数据基础。本实验首先确定了紫外线照射时间(20s,25s)与喹禾灵筛选浓度(5.5,6.0μmol/L),采用紫外线诱变与喹禾灵胁迫相结合的方法对莱茵衣藻CC-124进行定向选育。通过测定生长速率初筛出5株生长速度较快的突变藻株,用尼罗红染色对限氮培养第4天的藻细胞油脂进行观察,挑选出了2株油脂颗粒大且数目多的突变藻株:4-2-2和9-2-7。采用酸解法测定了出发株和突变株限氮培养第0、4、6天时中性脂的含量,2个突变藻株都表现出高于出发藻株的中性脂水平。利用GeNorm、BestKeeper和NormFinder三个内参基因筛选软件从18S rRNA、COX4、COX12、actin这四个候选内参基因中选出表达最稳定的COX12作为最适内参基因,对出发藻株、突变藻株4-2-2和9-2-7在限氮培养0、2、4、6天时4个微藻油脂代谢关键酶基因的转录水平进行了实时荧光定量PCR检测。这4个酶分别为乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)(包括DGAT1和DGAT2两个异构酶)。根据这些酶基因的转录水平分析及其相应的油脂含量,可以看出这两个突变藻株的油脂积累模式基本相同,都具有生长和油脂积累两方面的优势。尽管从中性脂含量看来,突变藻株9-2-7略高于突变藻株4-2-2,但后者在ACC基因和DGAT2基因表达上具有明显优势,有可能具有更持久的合成脂肪的能力。
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