背景WHO公布2003年席卷全球的SARS爆发流行,涉及32个国家和地区,全球累计病例8 422例,死亡人数919人,病死率约11%。2004年禽流感病毒甲型H5N1在南亚和东南亚爆发流行,致使超过1亿只家禽被捕杀,并传播人类导致感染患者的死亡。2009年4月自墨西哥出现的第一例甲型H1N1流感病毒感染患者至2010年3月,该病毒的大流行已蔓延全球213个国家和地区。2010年4月,WHO公布迄今为止甲型H1N1病毒大流行已造成17 000余人死亡。截至2010年3月31日,中国31个省累计报告甲型H1N1流感确诊病例120 000例,死亡病例超过800例。近7年新发感染性疾病(emerging infectious disease,EID)事件触目惊心,对人类健康、经济发展和社会稳定产生了巨大的影响,使人们对EID积极防控和健全相关公共卫生安全体系产生了许多新的认识,并对EID病原体给予了高度关注。目的本研究通过BDV分子流行病学调查和研究,建立中国西北伊犁地区新发病毒BDV感染动物样本库,获得BDV流行病学资料,了解不同种属动物BDV流行现状,分析BDV可能的种系来源,为制定预防和控制BDV爆发流行预案提供可靠依据,为健全公共卫生安全体系奠定坚实的基础。同时,建立BDV p40-OL细胞模型,为BDV发病机制的蛋白质组学研究提供平台;进一步评价BDV荧光定量PCR诊断试剂盒,为BDV流行病学调查和临床研究提供可靠的检测手段。方法1.根据BDV感染宿主地源特殊性和种属多样性,选择中国西北新疆伊犁地区作为样本采集地点;伊犁马、新疆驴、新疆双峰驼、天山马鹿和不同品种犬作为样本采集动物;外周血和脑组织作为样本采集对象。2.采用FQ-nRT-PCR方法,检测8个品种150例犬PBMCs BDV p24 RNA基因片段。用检测BDV p40 RNA片段和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品验证样本BDV p24阳性产物,排除可能出现的假阳性。验证后的阳性产物进行基因测序、核苷酸和氨基酸序列同源比对以及系统发生学分析。3.在5个种属8个品种873例动物PBMCs中,对伊犁马、新疆驴和哈萨克牧羊犬共检出的19例BDV p24 RNA阳性片段,进行BDV标准株He/80、strain V和H1766比对,分析核苷酸和氨基酸同源相似度,重构基因系统发生树,分析BDV可能的种系来源。4.培养人OL细胞株细胞,用含有BDV p40基因的质粒pEGFP- N1- BDV p40,经脂质体转染OL细胞。通过G418筛选已转染的OL细胞,获得BDV p40蛋白稳定表达的转染态OL细胞。RT-PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒BDV p40基因表达;观察GFP表达、测定IHC和ELISA,鉴定BDV p40蛋白表达。最后,建立稳定表达BDV p40的转染态OL细胞模型。5.试剂盒评价在热稳定性评价方面,将BDV p24荧光定量PCR诊断试剂盒中试剂分装多份一次PCR扩增反应量。随机取出其中2份分别置于25℃和37℃两种温度的恒温水浴箱内进行热处理。处理时间分别选择3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h和96 h共7个时间段。在相应温度和热处理时间完成后,对6个浓度梯度的质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品进行PCR扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过对PCR反应的CT值和R2值比较,评价试剂盒的热稳定性。在BDV检测信度评价方面,选择定量BDV(+)OL细胞和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品,进行BDV p24基因片段PCR扩增。通过比较两种检测对象检出BDV p24浓度梯度的一致性,评价试剂盒病毒检测结果信度。结果1.在样本采集方面,伊犁地区样本采集动物归属于5个种属8个品种。种属包括伊犁马、新疆驴、新疆双峰驼、天山马鹿和犬;品种有哈萨克牧羊犬、德国牧羊犬、卡罗来纳犬、西伯利亚雪橇犬、波音达猎犬、比格猎犬、德国杜宾犬和斗牛梗犬。样本采集动物数量合计897例,其中伊犁马582例,新疆驴204例,新疆双峰驼4例,天山马鹿1例,哈萨克牧羊犬95例,德国牧羊犬28例,卡罗来纳犬14例,西伯利亚雪橇犬8例,波音达猎犬6例,比格猎犬4例,德国杜宾犬3例,斗牛梗犬2例。样本采集对象为外周血、脑组织和全脑。采集样本的数量为外周血样本897份、脑组织样本1573份和全脑样本43份。2.在病毒检测方面,在8个品种150例犬中,仅哈萨克牧羊犬检出BDV p24片段,阳性率为11.0%(10/91)。基因序列与德国马BDV He/80和德国绵羊BDV S6病毒株同源相似度分别为99.2%和95.7%,氨基酸相似度为100%和89.3%。亲缘关系与He/80最近,其次为S6。3.在种系发生学方面,19例BDV p24核苷酸序列一部分形成伊犁独立支系,其余部分汇聚至伊犁-德国-瑞士混合支系。独立支系与标准病毒株无聚合,核苷酸序列同源相似度为98%,氨基酸序列为100%;德国马He/80汇聚混合支系,核苷酸与氨基酸序列与He/80同源相似度均为100%。4.在细胞模型建立方面,用RT-PCR扩增经pEGFP-N1-BDV p40转染的OL细胞中BDV p40基因核苷酸序列片段,扩增产物在琼脂糖凝胶电泳154 bp处出现一条清晰的条带,其大小与目的片段一致。倒置荧光显微镜观察,OL细胞核GFP表达量明显大于细胞质(细胞核/细胞质=2.43),证明了BDV p40蛋白核定位的生物学特点。用BDV多克隆抗体和CIC单克隆抗体检测pEGFP-N1-BDV p40、pEGFP-N1和正常OL细胞中BDV p40蛋白表达,结果显示,前者均为阴性,后者均为弱阳性,三者之间无差异。5.在试剂盒评价方面,试剂盒热稳定评价显示,经25℃和37℃热处理后,各温度7个不同时间段BDV p24 PCR反应CT值之间无差异,保持正常PCR扩增效率的热处理持续时间范围为3 h～96 h;25℃和37℃两种温度条件下不同时间段平均R2值之间亦无差异。BDV检测信度评价方面显示,在定量BDV(+)OL细胞(12个浓度梯度即100～10-11)和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品(6个浓度梯度即100～10-5)中,均可检测4个浓度梯度即100、10-1、10-2和10-3,最低检测浓度为10-3。结论1.伊犁地区所采集不同种属和品种的动物血液和脑组织样本量,可基本反映该地区BDV自然感染现状,纳入动物性别和年龄的同质性进一步提高了调查结果的可靠性。在国内外首次建立了马科动物快速开颅全脑采集的新方法。2.伊犁地区可能存在BDV自然感染,哈萨克牧羊犬为BDV贮存宿主,其自然感染阳性率为11.0%;该地区BDV流行病毒株可能与伊犁马BDV He/80的交叉感染和引进德国Saxony美利奴绵羊BDV S6病毒株的输入感染有关。3.首次提出了新疆伊犁河谷动物宿主中可能存在地源性BDV独立种系,形成哈萨克牧羊犬BDV KT078和KT079病毒株;同一种系BDV株在伊犁河谷不同种属动物间的感染,可能源于外来疫病病原体经草原丝绸之路的传播。4.质粒pEGFP-N1-BDV p40转染人OL细胞后BDV p40基因和蛋白在细胞内的稳定表达,建立了转染态BDV p40-OL细胞模型,为探索BDV p40单一病毒蛋白在宿主中的作用和BDV致抑郁症发病机制的蛋白质组学研究提供了有效的手段。5.荧光定量BDV p24诊断试剂盒在一定范围内不受温度(25℃/ 37℃)和在该温度下持续使用时间(3 h～96 h)的限制,具有较好的热稳定性;该试剂盒具有极高的BDV检测信度,可检测宿主细胞中10-3 BDV浓度。