真菌凝集素是一类来源于真菌,且不同于抗体和酶的蛋白质或糖蛋白,它能与糖特异和可逆地结合,并具有凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用。近年来,对真菌凝集素的研究发展较快,主要集中在其生理生化特性和生物学功能方面,如在植物防病抗虫、抗肿瘤、抗病毒和基因工程等方面有着较为深入的研究和应用。
　　本论文通过研究不同培养条件对香灰菌(Hypoxylon sp.)菌丝体合成凝集素的影响,优化其培养条件,然后从培养得到的菌丝体中分离纯化出凝集素,并对它的理化性质和生物学活性进行了初步的研究,为进一步的开发利用奠定基础。采用单因素实验对碳源、氮源和碳氮比等发酵条件进行了初步的优化筛选,确定了较适的发酵培养条件:碳源为乳糖,氮源为酵母膏,碳氮比为2:1。在此优化发酵条件下进行摇瓶发酵培养,香灰菌丝体中合成凝集素的最高效价为1600 U/mL。香灰菌菌丝经磨粉、浸取、硫酸铵分级沉淀,得到香灰凝集素粗品。再经DEAE-Cellulose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析,可获得纯化的香灰凝集素(Hypoxylon sp.lectin,HSL),纯化倍数为9.8倍,蛋白质回收率为13％。经SDS-PAGE检测为单一蛋白染色带,其亚基分子量约为15.7kDa。电泳凝胶经Schiff试剂染色后有一条淡弱的蛋白带,表明香灰凝集素中含有糖基,是一种糖蛋白。蒽酮-硫酸法测的HSL含有15.5％的中性糖。通过β-消去反应测得香灰凝集素中糖和蛋白质的连接键为O-型糖肽键。对HSL进行紫外光谱的扫描发现,其最大吸收波长为280.4 nm。HSL能够凝集天然的兔红细胞、鼠红细胞和人A、B、O型红细胞,但是未表现出血型专一性和种属专一性,其对兔红细胞的最低凝集浓度为0.02μg/mL。通过糖抑制实验显示其凝集活性会被乳糖和D-半乳糖所抑制,且D-半乳糖的抑制浓度要低于乳糖。凝集素的活性在20-40℃之间保持基本不变,在50℃及以上温度时活性对温度的变化比较敏感,可见HSL是一种热较不稳定糖蛋白。HSL经100mmol/LHCl处理后,其凝血活性降低到原来的1/8,而在相应浓度的NaOH处理后,其活性不受任何影响,但经3 mmol/L的NaOH处理后,其活性下降为原来的1/2。用EDTA去除HSL分子中的金属离子后,HSL的凝血活性丧失,表明HSL是金属离子依赖型凝集素,通过加入Al3+、Fe3+均可使其凝血活性恢复甚至增加,而加入Mg2+、K+对HSL活性的恢复无任何作用。抑菌实验表明,HSL表现出对高粱炭疽病原菌具有抑制作用,而在浓度为0.1mg/mL时不影响棉花枯萎、山药枯萎、番茄叶霉、番茄枯萎、黑曲霉、棉花红腐等真菌的生长,同时HSL对金黄色葡萄菌、大肠杆菌、志贺氏菌等细菌也无任何抑制作用。