我国每年死于冠心病的人数达100多万,临床上对冠心病-心肌梗死的治疗包括应用靶向溶栓药物治疗、冠状动脉旁路移植术(CABG)、经皮腔内冠脉血管成形术(PTCA)、心脏外科体外循环等方法,这些方法可使缺血区组织及早恢复血供,有效减少梗死面积。但是,却有相当一部分患者不适宜用上述方法治疗。如何挽救这部分患者的生命,一些学者提出了治疗性血管新生的概念。近年研究也证实,治疗性血管新生能帮助缺血区组织建立有效的侧支循环,从根本上缓解心肌缺血症状,已成为目前心血管临床研究的热点课题。巴戟天糖链(Morinda officinalis How oligosaccharides,MOO)是中药巴戟天的醇提物水溶性部分中的主要有效成分,导师组近年来致力于巴戟天糖链(MOO)对心血管保护方面的研究,结果显示,MOO能有效促进缺血心肌血管新生,提高缺血心肌微血管密度,显著诱导血管新生过程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、PDGF-B蛋白的表达。但MOO促进血管新生中,促进血管内皮细胞增殖的作用靶点及确切机制尚不明确。细胞膜上离子通道活性的改变可影响细胞周期的调节,进而影响细胞增殖,大量研究证实,大电导钙激活钾通道(BKCa)在血管平滑肌细胞和肿瘤细胞的增殖中发挥重要作用。因此,本实验以人脐静脉内皮细胞株(ECV304细胞)为研究材料,制作缺/复氧模型,诱发血管内皮细胞增殖,以麝香保心丸为阳性对照药,采用流式细胞仪检测细胞的增殖；应用全细胞膜片钳技术,研究MOO对血管内皮细胞增殖中BKCa通道的影响；通过内皮细胞血管生成因子基因芯片高通量检测,分析在MOO影响血管内皮细胞增殖中对血管生成相关基因表达的影响,从而更进一步的探讨MOO促进内皮细胞血管新生的作用机制。　　 目的：　　 观察巴戟天糖链(MOO)促进ECV304细胞增殖中,对BKCa通道的影响和血管生成基因谱的作用,以探讨MOO促进血管内皮细胞增殖的药理学机制。　　 方法：　　 确定细胞模型条件后,对正常传代生长3～8代的ECV304细胞进行缺氧1h、复氧2h处理,然后根据实验需要将细胞分为6组:正常培养组,缺/复氧模型组(H/R),H/R+阳性药物组,H/R+小剂量MOO组(50mg·L-1),H/R+中剂量MOO组(150mg·L-1),H/R+大剂量MOO组(450mg·L-1)。各组细胞继续培养24h后:①加入胰蛋白酶(含EDTA)吹打使分散均匀,用70％乙醇固定,检测时去除乙醇再加入RNA酶,用PI染料染色30min后进行FCM检测；②对细胞采用二次贴壁法处理,继续培养12h后应用全细胞膜片钳技术记录各组细胞中BKCa通道的电流；③加入Trizol试剂,并反复吹打使细胞均匀后,进行内皮细胞血管生成基因芯片(Endothelial Cell Biology Microarray)检测分析。数据结果应用SPSS17.0统计软件处理数据,数据以均数±标准差((x)±s)表示,组间比较采用单因素方差(ANOVA)分析,以α=0.05作为显著性差异的检验水平。图像采用Origin7.0软件处理。　　 结果：　　 1、缺/复氧模型条件的确立　　 用台盼蓝染色,血细胞计数板计数,计算各实验条件下细胞的死亡率,并与正常培养细胞比较,条件为缺氧1h、复氧2h处理的细胞死亡率5.21±2.02％与正常细胞相比有显著性差异(P<0.05)。故实验选择H1R2为细胞模型制作的实验条件。　　 2、流式细胞仪分析细胞各周期分配比例的变化　　 各实验组细胞周期的分配发生变化,G1期细胞所占的比例下降,G2/S％期细胞所占比例上升,分别为31.44±0.42％、43.20±1.09％、46.49±1.65％、33.45±0.87％、34.43±0.66％、55.44±0.76％。以G2/S％为评价标准,模型组与正常组之间比较,差异有显著性(P<0.05)。MOO不同剂量组之间比较,差异有显著性(P<0.05),且呈剂量依赖性。MOO大剂量组与阳性药物组之间比较,有显著性差异(P<0.05)。　　 3、全细胞膜片钳记录各实验组细胞中％通道的电流　　 在+60mV指令电压刺激下,各实验组细胞BKCa通道的电流密度分别为:13.75±0.51pA/pF(n=18)、14.85±0.72pA/pF(n=7)、18.94±0.85pA/pF(n=12)、15.97±0.79pA/pF(n=11)、17.68±0.68pA/pF(n=9)、19.72±1.03pA/pF(n=15)。模型组与正常组间比较,差异有显著性(P<0.05)。MOO不同剂量组之间比较,差异有显著性(P<0.05),呈剂量依赖性。MOO大剂量组与阳性药物组之间比较,有显著性差异(P<0.05)。　　 4、基因芯片检测分析血管生成基因谱表达量的改变　　 通过内皮细胞血管生成基因芯片检测了与血管生成相关的128种生长因子mRNA表达量,结果显示:与模型组相比较,MOO组可上调多种促血管生成因子mRNA的表达(ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、CXCL10、FIGF1、NRP1、NRP2、PLG、PLG、LEP、PTGS1、BAI1 etc)；并可下调多种抑制血管生成因子mRNA的表达(TGFB2、TNFSF15、TNFAIP2 etc)。MOO影响与血管生成相关的生长因子表达,促进血管内皮细胞的增殖以及血管新生。　　 结论：　　 1 MOO能促进缺/复氧损伤后ECV304细胞的增殖,诱发血管新生。　　 2 MOO促进ECV304细胞增殖及血管新生的作用与影响血管生长相关因子mRNA的表达有关。　　 3 MOO激活ECV304细胞BKCa通道,通过此靶点保护受损细胞并促进其增殖。MOO激活该通道后促进细胞增殖的信号转导途径,尚待进一步研究。