CRISPLD2蛋白及CRISPLD2-anti-HMGB1双功能融合蛋白治疗脓毒症小鼠的研究

来源 :第二军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yanhsy
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第一部分CRISPLD2蛋白对HMGB1诱导的炎症反应的影响及治疗脓毒症小鼠的效果目的:探索CRISPLD2蛋白对HMGB1诱导的炎症反应的影响及对脓毒症小鼠血清炎症因子水平的影响。探索CRISPLD2蛋白是否影响脓毒症小鼠生存率。方法:使用不同浓度的HMGB1蛋白刺激THP-1细胞,于0h、1h、3h、6h、12h、24h检测THP-1细胞内CRISPLD2蛋白的表达。筛选对CRISPLD2蛋白干扰效率最高的小干扰RNA (siRNA)转染THP-1细胞,在敲低内源性CRISPLD2蛋白后使用HMGB1刺激THP-1细胞,检测THP-1细胞内炎症因子和趋化因子转录的情况。使用HMGB1刺激THP-1细胞同时加入外源性重组CRISPLD2蛋白,检测CRISPLD2蛋白对THP-1细胞内炎症因子和趋化因子转录的影响。给予脓毒症小鼠静脉注射重组CRISPLD2蛋白,24h后检测血清炎症因子水平,并记录注射CRISPLD2蛋白后脓毒症小鼠的10d生存曲线。结果:HMGB1可呈剂量依赖性和时间依赖性刺激THP-1内CRISPLD2蛋白的表达。敲低THP-1细胞中内源性CRISPLD2蛋白可增加HMGB1诱导的THP-1细胞内炎症因子(TNF-α、IL-6)和趋化因子(MCP-1、IL-8)的转录。加入外源性重组CRISPLD2蛋白可部分逆转HMGB1诱导的THP-1细胞内炎症因子和趋化因子的转录。静脉注射CRISPLD2蛋白可降低脓毒症小鼠血清炎症因子水平,但不能延长脓毒症小鼠生存时间。结论:CRISPLD2蛋白可以减轻HMGB1诱导的炎症反应,降低脓毒症小鼠血清炎症因子水平,但不能提高脓毒症小鼠生存率。第二部分CRISPLD2-anti-HMGB1双功能融合蛋白的合成及功能鉴定目的:设计并合成双功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1,确定其与LPS和HMGB1的亲和力及热平衡解离常数Kd(M)值。方法:利用基因工程技术将CRISPLD2蛋白共价连接于anti-HMGB1抗体Fc段,形成CRISPLD2-anti-HMGB1双功能融合蛋白。使用考马斯亮蓝和PAGE电泳鉴定目的蛋白。利用BiaCORE技术测定双功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1与LPS和HMGB1的亲和力及热平衡解离常数Kd(M)值。竞争性ELISA技术测定该融合蛋白与LPS和HMGB1的相互作用及竞争结合抑制曲线。结果:双功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1大小约250kD,其与LPS结合的亲和力与天然CRISPLD2与LPS的亲和力类似,Kd(M)值为(3.11±0.21)*10-6,其与HMGB1结合的亲和力与anti-HMGB1类似,Kd(M)值为(2.02±0.68)*10-10。在竞争性结合抑制实验中,该融合蛋白对LPS和HMGB1的竞争性结合抑制曲线与天然CRISPLD2和anti-HMGB1的竞争性结合抑制曲线相似。结论:双功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1可与LPS和HMGB1结合,且亲和力较高。第三部分CRISPLD2-anti-HMGB1双功能融合蛋白对炎症反应的影响及治疗脓毒症小鼠的效果目的:探索双功能融合蛋白CRISPLD2-anti-HMGB1的体内代谢动力学。探索该融合蛋白对炎症因子表达、炎症通路激活的影响。探索该融合蛋白对脓毒症小鼠器官功能的保护作用和生存率的影响。方法:予小鼠注射50mg/kg的CRISPLD2-anti-HMGB1双功能融合蛋白,于注射后1h, Id,3d,7d, 10d,14d取静脉血测定该融合蛋白浓度。使用LPS(O.lng/ml)和HMGB1 (0.1ug/ml)的混液分别与CRISPLD2蛋白、anti-HMGB 1、CRISPLD2-anti-HMGB 1共孵育后再刺激THP-1细胞,检测各组炎症因子和趋化因子的转录情况,炎症通路NF-kB和MAPK中p-p65、p-p38、 p-pJNK1/2、p-pERK1/2的表达情况。分别予脓毒症小鼠注射治疗剂量的CRISPLD2蛋白、anti-HMGB1、CRISPLD2-anti-HMGB1,24h后检测小鼠血清炎症因子水平,肺组织病理变化,记录10d生存曲线。结果:CRISPLD2-anti-HMGB1双功能融合蛋白的体内半衰期约为4d。在体外,该融合蛋白可降低LPS和HMGB1混合液诱导的THP-1细胞内炎症因子(TNF-a、IL-6)和趋化因子(MCP-1、IL-8)的转录及炎症通路中p-p65、p-p38、 p-pJNK1/2、p-pERK1/2的表达。在体内,该融合蛋白可降低脓毒症小鼠血清炎症因子水平(TNF-a、IL-6),逆转脓毒症导致的肺组织损伤,增加脓毒症小鼠生存时间。并且该融合蛋白对生存时间的延长呈剂量依赖性。结论:CRISPLD2-anti-HMGB 1能够有效抑制炎症反应,保护脓毒症小鼠器官,延长小鼠生存时间。
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