卡莫司汀[1,3-bis(2-chloroethyl)-l-nitrosourea(BCNU,also called as carmustine)]缓释植入剂药物进入机体后,出现两种不同的效应。一是卡莫司汀缓释植入剂对机体产生的生物效应。另一个是卡莫司汀缓释植入剂机体对药物的作用,包括药物的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)和排泄(excretion),即所谓ADME。简言之,针对卡莫司汀缓释植入剂的药物代谢动力学研究,作为定量研究药物(包括外来化学物质)在生物体内吸收、分布、排泄和代谢(简称体内过程)规律的一门学科,在指导卡莫司汀缓释植入剂的设计、优化给药方案、改进剂型、提供高妙、速效、长效、低毒、低副作用的药剂方面发挥了重要作用,并揭示药物在体内的动态变化的规律性,研究药物在体内积蓄的部位以及积蓄的程度,药物的血浆蛋白结合率,代谢物的结构、转化途径及其动力学,排泄途径、速率和排泄量等,为临床安全合理用药提供依据和参考。由于分析技术手段的迅速发展加快了创新药物的研究进度,大量候选化合物进入了新药开发领域。但很多像卡莫斯汀一样在体内毒性较大等原因而无法进行开发,这样造成了很大的人力和财力的浪费。90年代大约有40%的化合物由于药动学方面的原因(如体内吸收差,生物利用度低,首过效应大,半衰期短,可诱导或抑制药物代谢酶等)而被淘汰,这足以说明药代动力学在新药开发中的重要作用。卡莫司汀[1,3-bis(2-chloroetlhyl)-l-nitrosourea(BCNU,also called as carmustine)]属亚硝脲类烷化剂,临床上主要用于治疗原发及继发颅脑恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、黑色素瘤及肺癌等。该药物脂溶性好,分子量小,容易穿透血脑屏障。但其体内外半衰期均较短,使其疗效不能充分发挥。该卡莫司汀缓释制剂属于增加新适应症的分类I化学合成新药。受蓝金生物公司委托,进行卡莫司汀缓释制剂的肝脏和胰腺内毒代研究。实验目的:本实验考察卡莫司汀植入缓释制剂在家兔肝脏内和大鼠胰腺内的药物释放情况,明确该药物的缓释速度和植入部位的组织药物浓度及病理学变化。试验方法:建立一种简便、准确、灵敏和专属能够同时检测组织及血浆中卡莫司汀浓度的HPLC-MS/MS 方法;采用上述方法测量卡莫司汀(carmustine)缓释植入剂在家兔肝脏内给药后不同天数残余药粒卡莫司汀的含量,以原药粒中的药量为100%,分析药物释放速度;采用上述方法测量按距药粒包埋位置的远近程度均匀分为8份的肝组织中含药量;采用上述方法测量血浆药物含量,并观察给药后给药部位周围肝组织的病理变化。最后观察各个时期家兔肝脏植入卡莫司汀后的形态变化。采用上述方法测量卡莫司汀(carmustine)缓释植入剂在Wistar大鼠胰腺上给药不同天数的胰腺中残余药粒卡莫司汀的含量,以原药粒中的药量为100%,分析药物释放速度;采用上述方法测量胰腺组织中含药量;采用上述方法测量血浆药物含量,并观察给药后给药部位周围胰腺组织的病理变化。最后观察各个时期Wistar大鼠胰腺植入卡莫司汀后的形态变化。实验结果:1.质谱法测定组织及血浆中卡莫司汀浓度的方法学确证结果:卡莫司汀标准品在浓度为2～1000 ng/mL范围内线性关系良好,最低定量限为2 ng/mL。日内精密度为2.9～6.4%、日间精密度为7.3～13.4%,准确度为-6.4～2.0%,结果表明在浓度2～1000ng/mL范围内测定的日内及日间重现性良好。肝组织样品在-20℃放置90天稳定性良好,血浆样品反复冻融3次稳定性良好,储备液在-20℃放置35天稳定性良好。在该分析方法能够满足卡莫司汀在血浆及组织样品中测定要求。2.卡莫司汀(carmustine)缓释植入剂在家兔肝脏内的释放速度和局部组织观察的结果:给药后7、15、30和60天的累积释药量分别为37.4%± 4.2%、75.2%± 12.0%、99.9%±0.1%和100.0%±0.0%,药物释放比较缓慢,大约需要1个月的时间释放完毕;血浆中药物浓度均低于定量下限;由肝组织中药物浓度的测定结果知给药后7天和15天的有效抑瘤半径范围分别为 0.96cm±0.03cm 和 1.28cm±0.11cm。植入7天时给药局部的肝脏组织内肝窦淤血、大量肝细胞出现空泡样变及胞膜缺损,并可见大量炎性细胞浸润,急性期炎性反应明显。随着药物的释放,植入15天给药局部的肝脏组织正常肝窦及小叶结构已破坏,出现较明显的肝组织细胞坏死现象。植入30天时可见肝组织坏死范围进一步扩大。60天的病理切片结果显示1#、2#、3#、4#和6#家兔均可见肝组织结构开始恢复正常,但5#家兔结果仍可见明显的肝细胞变性坏死现象,提示存在一定的个体差异。观察家兔肝脏植入卡莫司汀后的形态变化:卡莫司汀植入家兔肝脏后7天可见药粒膨胀变大,轮廓明显;15天时药粒的轮廓变得不明显,药粒被包裹;30天时两粒药物变成一团,破开后可见其有胶状物质;60天时已看不到药物,在肝的表面仍可见白色物质,疑为未完全吸收的辅料被肝排异至肝表面。各时间点的肝组织细胞均正常,提示各时间点的给药部位的肝组织的病理病变不是由于手术引起的。3.卡莫司汀(carmustine)缓释植入剂在大鼠胰腺内的释放速度和局部组织观察的结果给药后7天、15天、30天和60天的累积释药量分别为55.55%± 11.98%、86.43%± 7.17%、91.31%± 9.41%和100.0%±0.0%,药物释放比较缓慢,大约需要1-2个月的时间释放完毕。大鼠血浆中有痕量的药物分布,大部分低于定量下限。将4mg卡莫司汀的缓释制剂置入大鼠胰腺内7天、15天、30天和60天后观察胰腺给药部位的病理切片发现:给药7天后胰腺组织内充血,大量腺体组织细胞坏死,炎性细胞浸润,明显炎性反应,空泡样变等急性期反应,细胞固化严重。给药15天后胰腺组织大量坏死,出现大范围的坏死样结构,看不到正常腺体组织细胞结构,出现大量的空泡。给药后30天,随着药物的释放,腺体组织细胞全部坏死,已经看不到正常的细胞。给药60天后观察胰腺给药部位的病理切片发现:胰腺组织开始恢复,坏死细胞被包裹,吞噬,坏死组织细胞减轻,有新的细胞生成,能看到正常细胞结构,胰腺组织进入了恢复期。观察各时间点手术对照组的病理切片发现,各时间点的胰腺组织细胞均正常,提示各时间点的给药部位的胰腺组织的病理病变不是由于手术引起的。观察大鼠胰腺植入卡莫司汀后的形态变化:卡莫司汀植入大鼠胰腺后7天可见药粒膨胀变大,轮廓明显,15天时药粒的轮廓变得不明显,药粒被包裹,30天时药物变成一团,破开后可见其有胶状物质,60天时已看不到药物。由于大鼠胰腺体积较小,无法测量按距药粒包埋位置的远近程度均匀等分的组织中含药量,因此本次试验中直接测定了半个胰腺组织浓度,结果显示7天时胰腺组织的平均药物浓度为8875.5±8561.7ng/g,15天时浓度已经降至571.7±763.2 ng/g。实验结论:本文建立了灵敏、准确、简便和稳定的定量检测卡莫司汀缓释植入剂在新西兰大白兔肝脏匀浆液和血浆中的HPLC—MS/MS生物分析方法,定量分析范围为2～1000ng/mL,定量下限为2ng/mL。对该方法进行方法学确证,结果显示该方法的日间和日内精密度(RSD)均在2.9%～13.4%,准确度(RE)在-6.4～2.0%,同时专属性强,回收率高,无基质效应,稳定性良好,表明此定量分析方法符合生物样品分析方法指导原则要求[7-8]。通过本实验建立的分析方法对卡莫斯汀缓释植入剂在新西兰大白兔肝脏进行了药物浓度的检测,其结果表明:卡莫斯汀缓释植入剂在兔肝脏中药物扩散的浓度随着植入距离的增加而降低,其有效浓度在1.28cm之内,药物置入后第15天时药物浓度最大。但血浆中药物浓度不仅低于定量下限,而且远远低于有效抑瘤浓度,故不会产生全身性不良反应。本文报道卡莫斯汀缓释植入剂在新西兰大白兔肝组织匀浆液和血浆中药物浓度的数据,为临床安全合理用药提供参考。将卡莫司汀的缓释制剂置入7天、15天、30天和60天后观察给药部位的病理切片发现:给药7、15天后组织内充血,大量腺体组织细胞坏死,炎性细胞浸润,明显炎性反应,空泡样变等急性期反应,细胞固化严重,组织大量坏死,出现大范围的坏死样结构,看不到正常腺体组织细胞结构,出现大量的空泡。给药后30天,随着药物的释放,腺体组织细胞全部坏死,已经看不到正常的细胞。给药60天后观察给药部位的病理切片发现:胰腺组织开始恢复,坏死细胞被包裹,吞噬,坏死组织细胞减轻,有新的细胞生成,能看到正常细胞结构,胰腺组织进入了恢复期。