目的:利用生物信息学技术预测、筛选和制备弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(SAG1)融合抗原免疫优势表位，分析以HPV16L1为载体携带融合抗原ROP2-SAG1优势表位的免疫效应研究。　　方法:基于弓形虫融合抗原ROP2-SAG1氨基酸序列的基础上，利用Protean软件，分析ROP2-SAG1的亲水性，表面可及性，抗原指数及柔韧性;利用PORTER程序，将易于形成优势表位的β-转角、无规卷曲处确定出来，而将不易于形成表位的α螺旋、β折叠区域排除。利用ABCPred软件初步预测ROP2-SAG1分子中B细胞表位，结合抗原指数计算方法预测优势B细胞表位。利用Internet网络资源的SYFP EITHI等预测软件，综合预测、筛选HLA限制性T细胞表位，筛选既是优势B细胞表位，同时又包含优势T细胞表位的优势表位。将优势表位相应基因片段克隆至pET32a(+)原核表达载体，转化至大肠埃希菌Roseta菌株（Roseta）中诱导表达，离子螯合亲和层析柱(Ni-NTA)纯化表达产物，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物。以纯化的优势表位表达产物为免疫原，皮下多点注射日本大耳白兔，设pET32a(+)载体蛋白和PBS为对照，以纯化的优势表位蛋白作包被抗原ELISA法检测第0、2和4周免疫兔血清中表位特异性抗体IgG的产生时间及效价，免疫斑点实验验证免疫血清多克隆抗体的特异性。将优势表位相应基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)即构成弓形虫融合抗原ROP2-SAG1优势表位(即pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope），在此基础上将HPV16L1基因片段克隆至pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）构成pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）/HPV16L1。构建成功的重组质粒使用Lip-2000转染试剂转染COS-7细胞48h后，细胞提取RNA进行RT-PCR,以及收集细胞裂解液上清，进行Western blot鉴定，以及重组质粒转染COS-7细胞48h后进行免疫荧光鉴定其是否能够在体外进行特异性的表达。构建成功的重组质粒通过去内毒素质粒抽提试剂盒大量抽提，通过肌肉注射免疫方式连续三周免疫BALB/c小鼠，pcDNA3.1(+)作为阴性对照。ELISA法检测第0，2，4和6周免疫小鼠血清中表位特异性抗体IgG的产生时间及效价，以及特异性抗体IgG不同亚类之间引起Th反应的区别。以及通过酶联免疫斑点分析技术(ELISPOT)检测免疫鼠脾细胞γ干扰素产生能力。　　结果:1.通过生物信息学软件成功预测和筛选出以柔性肽相连接的一个88氨基酸序列，包含3个B细胞表位，3个HLA-A*0201限制性、2个HLA-A*2402限制性、1个HLA-DRB1*1501限制性、2个HLA-DRB1*0401限制性、2个HLA-DRB1*0301限制性T细胞表位，Blast-P分析与人、小鼠蛋白序列无同源性。　　2.在原核表达体系中获得了30KD大小的弓形虫融合抗原ROP2-SAG1优势表位融合表达产物。纯化的表位蛋白免疫大耳白兔，血清中可检测到相应的表位特异性抗体IgG，其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势，优势表位免疫组第2、4周兔血清抗体显著高于载体pET32a(+)蛋白对照组（均P＜0.05），以第4周的免疫血清测定多克隆抗体效价可达1∶40960。通过免疫斑点试验证实多克隆抗体针对优势表位具有良好的特异性。　　3.重组质粒体外转染COS-7细胞后，经过RT-PCR检测证实重组质粒能够在体外细胞中成功转录，通过Western blot，和免疫荧光实验证实其能够在体外进行特异性表达。　　4.重组质粒免疫小鼠后，免疫血清能够检测到相应的表位特异性抗体IgG，其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势，优势表位免疫组以及优势表位/HPV16L1免疫组第2，4，6周小鼠血清抗体效价显著高于pcDNA3.1(+)阴性质粒对照组（均P＜0.05），且与优势表位免疫组相比优势表位/HPV16L1免疫组的小鼠血清抗体效价显著提高(P＜0.05)。以第4周的免疫血清测定多克隆抗体效价重组质粒免疫组均可达1∶640。以pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1（multiepitope）/HPV16L1重组质粒免疫组为例进行特异性抗体IgG亚类的测定，结果显示从2周开始特异性抗体IgG1显著高于IgG2a(P＜0.05)，指出弓形虫融合优势表位诱导机体主要产生Th1反应。优势表位免疫鼠以及优势表位/HPV16L1免疫鼠脾细胞以3条特异性CTL表位肽刺激后γ干扰素的产生水平分别为表位肽1（16.6±1.1/10万细胞，25.13±1.81/10万细胞）、表位肽2（21.6±1.7/10万细胞，31.86±1.1/10万细胞）、表位肽3（45.8±2.8/10万细胞，66.93±2.1/10万细胞），均显著高于pcDNA3.1(+)阴性质粒免疫对照组（均P＜0.05），且CTL表位联合Th表位的组合肽刺激γ干扰素产生水平（表位肽3（45.8±2.8/10万细胞，66.93±2.1/10万细胞）分别显著高于两组单独的CTL表位肽刺激组（表位肽一16.6±1.1/10万细胞，25.13±1.81/10万细胞、表位肽二21.6±1.7/10万细胞，31.86±1.1/10万细胞）（均P＜0.05）。且与优势表位免疫组相比，优势表位/HPV16L1免疫组其特异性CTL表位肽刺激后γ干扰素的产生水平明显升高(P＜0.05)。　　结论:1.预测和筛选到了弓形虫免疫优势T、B细胞表位人工合成弓形虫融合抗原ROP2-SAG1优势表位(即/ROP2-SAG1(multiepitope))。　　2.成功构建了原核表达重组质粒pET32a(+)/ROP2-SAG1（multiepitope），真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1(multiepitope)以及pcDNA3.1(+)/ROP2-SAG1(multiepitope)/HPV16L1　　3.构建成功的原核表达质粒能够在原核表达体系中进行表达，其表达产物免疫日本大耳白兔产生的多克隆抗体对优势表位具有良好的特异性。　　4.构建成功的真核表达质粒，能够在体外成功转录并且翻译成表达产物。　　5.筛选的弓形虫融合抗原ROP2-SAG1免疫优势表位通过构建真核表达质粒以及构建携带有载体HPV16L1的真核表达质粒，两者在体内具有显著的免疫原性，且载体HPV16L1对于优势表位的表达及免疫原性具有显著的增强效果。