山梨醇是许多蔷薇科植物中主要的光合产物,也是碳水化合物的主要运输形式和贮藏物质,与植物的生长、果实品质和产量等密切相关。研究表明,山梨醇还可以作为小分子渗透物质当植物遭遇逆境时在体内积累。山梨醇的积累对提高植物抗旱、抗盐碱、抵御低温、抗火疫病、清除活性氧等能力具有重要作用。山梨醇还能与硼形成复合物而提高植物体内硼的运输能力。参与山梨醇代谢的关键酶(蛋白)包括6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)、山梨醇运输蛋白(SOT)和山梨醇脱氢酶(SDH)。本研究以‘嘎拉’苹果(Malus domestica cv. Gala)为材料,克隆了与山梨醇代谢相关的基因S6PDH、SOT和SDH,并利用实时荧光定量PCR分别分析了这些基因在苹果不同时空的表达模式;获得了S6PDH基因启动子序列并进行了活性分析;利用GFP和胶体金免疫电镜技术研究了S6PDH在细胞中的定位。获得的主要结果如下:1.克隆了S6PDH基因cDNA全长序列,该序列长1080bp,编码310个氨基酸。获得了两个大小分别为3595bp和3402bp的S6PDH基因gDNA序列。结构分析表明,两个gDNA序列都是由6个外显子和5个内含子组成。两个gDNA序列大小不同是由于后三个内含子长度不同造成的。实时定量RT-PCR分析发现,S6PDH基因在幼叶中相对表达水平较低,随叶龄的增加基因表达水平明显提高,在成熟叶片中达到最大量。随着叶片的衰老,S6PDH基因的表达水平呈现显著的降低趋势。此过程中S6PDH酶活性与基因表达呈现出基本一致的变化趋势。在干旱胁迫和盐胁迫条件下,S6PDH基因表达量随胁迫的加重而上升,当胁迫达一定程度时S6PDH基因表达急剧下降。结果表明S6PDH的表达与叶片从库到源的功能转化功能密切相关,转录水平是S6PDH表达的关键调控步骤。将苹果S6PDH基因通过农杆菌介导法转入猕猴桃中,对获得的抗性植株进行了PCR检测和Southern杂交检测,共获得了5个转基因株系。证明已将苹果S6PDH基因转入猕猴桃中。2.洋葱表皮亚细胞定位结果表明,GFP-S6PDH融合蛋白主要定位于细胞质中。免疫细胞化学标记结果表明,经苹果S6PDH抗体孵育和山羊抗兔免疫球蛋白-胶体金标记后,胶体金颗粒主要沉积于细胞的胞质和叶绿体中,表明苹果叶片中S6PDH主要定位于胞质和叶绿体中,在细胞其他部位没有分布。3.克隆到了S6PDH基因启动子序列。该序列长2396bp,序列分析表明该启动子区包括多种顺式作用元件。将该序列插入表达载体pC0390-GUS中并转化烟草,经GUS组织化学染色,证明本研究获得的启动子具有转录活性。构建了一系列启动子5`端缺失体并转化烟草,经GUS组织化学染色和活性测定,发现启动子序列中-2122~-1719bp区域和-1066~0bp区域在调节基因转录方面起重要作用。4.克隆到了3个SDH基因家族成员MdSDH7、MdSDH8和MdSDH9,其全长cDNA序列长度分别为1418bp、1446bp和1388bp,编码371、368和368个氨基酸。它们的gDNA序列长度分别为2176bp、1239bp和1246bp。结构分析表明,MdSDH7的gDNA序列由6个外显子和5个内含子组成,而MdSDH8和MdSDH9的gDNA序列都是由2个外显子和1个内含子组成。实时定量RT-PCR的分析结果发现,在整个果实生长过程中,MdSDH7基因在果实生长后期表达较高,MdSDH8基因在果实生长中、后期表达较高,MdSDH9基因在果实生长中期表达较高。SDH活性在果实生长初期(花后0d和15d)最高,随着果实的成熟活性开始急剧下降,在花后92d活性有所上升,但增加不大,随后又开始下降。果实相对生长速率与SDH活性变化呈现出相同的模式。MdSDH8和MdSDH9在幼叶中表达量很高,随叶片的成熟表达量显著下降,而MdSDH7则与它们表现出相反的表达变化趋势。幼叶中SDH活性最高,随叶片成熟活性显著下降,但当叶片进入衰老期后活性又再次升高。在幼果中,MdSDH7、MdSDH8和MdSDH9三个基因都在种子中表达量最高,在果肉和果皮中的表达量差异不大。在成熟果中,MdSDH7基因在种子和果皮中的表达量较高,MdSDH8基因在种子中的表达量较高,MdSDH9基因在果肉中的表达量较高。幼果中SDH的活性在种子最高,果肉和果皮中的活性基本一致。相反的是,成熟果果皮和果肉中SDH活性较高,而种子中SDH活性较低。以上结果表明,果实生长过程中SDH活性与RGR变化呈现一致的趋势,表明SDH活性与果实“库”强度密切相关。SDH活性变化与基因表达模式不一致,这可能是由于基因家族成员共同作用的结果,也可能是SDH基因表达存在转录后调控机制。5.获得了4个SOT基因家族成员MdSOT7、MdSOT8、MdSOT9和MdSOT10,其全长cDNA序列长度分别为1681bp、1755bp、1797bp和1849bp,编码538、526、491和535个氨基酸。用扩增基因全长的引物对苹果基因组DNA进行扩增,发现MdSOT7、MdSOT8、MdSOT9和MdSOT10的gDNA序列长度分别为2616bp、2230bp、2397bp和3013bp。结构分析表明,4个SOT基因gDNA序列都是由3个外显子和2个内含子组成,但是外显子和内含子的长度和位置差异很大。实时定量RT-PCR分析表明,MdSOT7基因在各时期叶片中表达水平较低且表达量基本不变,MdSOT8、MdSOT9和MdSOT10三个基因在成熟叶中表达较高。MdSOT7在果实发育初期和后期表达较高,MdSOT8在果实发育中期表达较高,MdSOT9在整个果实发育阶段都有表达且变化不大,MdSOT10在果实发育初期表达量较高。