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背景:自1990年英国学者提出“成人疾病的胎儿起源”学说后,母体甲状腺机能减退对子代成年后退行性疾病和代谢性疾病的影响受到越来越多的关注。母体甲状腺来源的甲状腺激素对子代生长发育和代谢发挥重要的作用,母体甲减可导致胎儿宫内发育迟缓,影响神经系统、皮肤、肺脏和骨骼系统的发育。而孕期甲状腺机能减退对子代糖代谢的影响也得到了证实,但是其具体机制尚不明确。甲状腺激素受体(Thyroid hormone receptor,THR)是甲状腺激素发挥生物学效应的重要途径,目前已知活性甲状腺激素可通过甲状腺激素受体β(Thyroid hormone receptor β,TRβ)对胰岛素分泌及β细胞增殖产生影响,但宫内甲状腺激素缺乏是否通过TRβ受体途径对子代胰岛细胞功能产生影响尚无研究报道。目的:本研究以抗甲状腺药物丙硫氧嘧啶(PTU)诱导甲状腺机能减退大鼠模型,观察产后及仔鼠各观察阶段甲状腺激素水平,评估母体甲状腺机能减退对子代胰岛发育的影响及血糖代谢的作用,观察母鼠甲减对胰腺增殖功能和胰岛素分泌能力的影响,并观察胰腺TRβ表达的变化。通过细胞实验观察甲状腺激素对胰岛β细胞增殖、胰岛素分泌功能影响,并探讨TRβ对甲状腺激素的调控作用。从而为青年起病的糖尿病的预防治疗及新药研发提供科学理论依据和实验依据。方法:动物实验部分:将生长至180-220 g的雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠分为母鼠甲减组(maternal hypothyroidism,MH)和对照组(control),利用抗甲状腺药物PTU加入自然饮水的方法制备SD大鼠甲状腺机能减退模型。MH组雌鼠与雄鼠交配后的SD孕鼠母体模拟胎儿宫内甲减状态,而对照组摄入普通饮水,孕期持续监测甲状腺激素T4和TSH,以评价造模是否成功,此外监测母鼠分娩后甲功,以评估模型是否具有持久稳定性。观察孕鼠妊娠率、孕期体重增加情况、仔鼠出生后体重和甲状腺功能,以评估母鼠甲减围生期结局。通过口服葡萄糖耐量试验观察雄性仔鼠各观察时期糖代谢情况,取两组实验大鼠的胰腺组织,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)及组织免疫染色方法观察子代各观察时期胰岛中增殖标志蛋白Ki67 mRNA、insulinl mRNA、insulin2 mRNA、TRβ31 mRNA和TRβ2 mRNA及蛋白的表达,以了解母体甲状腺机能减退对子代成年后血糖代谢的影响、胰岛细胞增殖功能和胰岛素合成和分泌功能的影响及机制。细胞部分:常规方法培养小鼠胰岛细胞株MIN6细胞,分别用不同浓度甲状腺激素T3(10-8、10-7、10-6、10-5、104、10-3、10-2 mM)干预MIN6细胞24、48、72小时,用CCK-8(cell counting kit-8,CCK-8)测定不同时间段、不同浓度T3对MIN6细胞活力的影响,确定T3最佳作用浓度为10-4 mM,最佳作用时间为72小时,选择该浓度为干预浓度。构建稳定表达TRβ的小鼠胰岛素MIN6细胞稳转细胞株。将培养的细胞分为4组:空质粒对照组(NC),空质粒对照+T3干预组(NC+T3),TRβ过表达细胞组(TRβ),TRβ过表达细胞+T3干预组(TRβ+T3),观察72小时,利用葡萄糖刺激胰岛素分泌试验(Glucose-stimulated insulin secretion test,GSIS)检测每组细胞胰岛素分泌功能,利用RT-PCR检测细胞Ki67 mRNA、Insulinl mRNA、Insulin2 mRNA表达水平,以确认甲状腺激素T3是否通过TRβ发挥促胰岛素分泌作用和细胞增殖功能。结果:动物实验中,母鼠甲减组妊娠率为36.36%,低于正常对照组的70%(p<0.05),甲减组孕期体重增长较正常组下降(118.5±9.5 vs 154.8±9.7g,p<0.05)。且母鼠甲减组的雄性仔鼠出生体重明显低于正常对照组(5.43±0.10 vs 7.30±0.12g,尸<0.001),连续观察体重至8周龄母鼠甲减组雄性仔鼠的体重均低于对照组仔鼠,4周、8周龄时母鼠甲减组和对照组体重分别为(74.01±1.75 vs 86.78±2.80g,pp<0.01),(130.4±11.48 vs 202.4±9.28g,p<0.001)。两组雄性仔鼠出生时甲状腺激素T4水平差异无统计学意义(0.37±0.06 vs 0.33±0.02μg/dL,p>0.05),而母鼠甲减组仔鼠TSH水平显著高于对照组仔鼠(3.08±0.05 vs 2.37±0.28 ng/mL,p<0.05),但出生4周后两组仔鼠TSH、T4水平差异均无统计学意义。母鼠甲减组仔鼠出生当天的随机血糖为7.05±0.21 mmol/L,高于对照组6.47±0.10 mmol/L(p<0.05),进一步对各观察时期仔鼠行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)显示母鼠甲减组仔鼠4周龄时各检测点血糖水平与对照组均无统计学差异,而在8周龄时空腹血糖明显高于对照组仔鼠(8.13±0.38 mmol/L vs 6.63±0.19 mmol/L,p<0.05),糖负荷后血糖变化趋势与对照组相似,均出现于15min,但母鼠甲减组血糖值高于对照组(17.84±0.81 mmol/L vs 14.34±1.21 mmol/L,p<0.05)。胰腺组织H&E染色显示,4周龄、8周龄时甲减组仔鼠胰岛形态结构和正常组无明显差异,然而RT-PCR结果和胰腺组织免疫组化结果显示,胰岛细胞胰岛素合成和细胞增殖标志物的mRNA和蛋白表达水平均低于对照组。体外实验中,CCK-8结果显示甲状腺激素T3能明显促进MIN6细胞的增殖,并呈浓度和时间依赖性,T3最佳作用浓度为10-4mM。通过RT-PCR发现,NC组MIN6细胞加入含T3的培养液后,Ki67 mRNA、Insulin1 mRNA、Insulin2 mRNA表达增加,同时TRβmRNA表达上调。TRβ+T3组细胞增殖标志物Ki67 mRNA的水平较对照组显著增加(p<0.05)。GSIS显示,TRβ+T3组的MIN6细胞经高糖刺激后,胰岛素释放量显著高于NC组细胞(p<0.05)。结论:母体甲状腺机能减退可导致母鼠妊娠率下降,体重增加减少;并导致雄性仔鼠出生后0-8周生长发育迟缓,由此认为孕期甲状腺机能减退与围生期不良结局相关。甲状腺激素T3有明确的促进MIN6细胞增殖和胰岛素分泌的能力,宫内甲减可能通过子代胰腺中TRβ基因适应性下调,导致胰腺细胞增殖、胰岛β细胞分泌胰岛素的能力下降,最终导致子代青年期开始出现空腹血糖升高及糖耐量异常,故母体甲状腺激素可能通过TRβ受体对子代胰腺细胞增殖和胰岛素分泌发挥重要的作用,TRβ受体表达的下调可能是早发糖尿病的关键调节因子。