广州管圆线虫病（Angiostrongyliasis cantonensis）是由广州管圆线虫Angiostrongylus cantonensis (Ac)引起的以中枢神经系统炎症为主的食源性寄生虫病。软体动物螺类，如非洲大蜗牛Achatina fulica (Ferussac,1821)、福寿螺Pomacea canaliculata (Lamarck,1819)是Ac中间宿主、大鼠是Ac的终宿主、人和小鼠等是其非适宜宿主。人多因生食含有三期幼虫的淡水螺肉而感染。广州管圆线虫病主要在东南亚和太平洋岛屿流行。自1945年台湾首例报道之后，国内也陆续出现新发病例报道，而且在浙江和北京均出现大规模爆发流行，我国卫生部于2003年将广州管圆线虫病列为新发传染病。目前，临床上广州管圆线虫病主要诊断依据包括三个方面：接触史、临床症状和ELISA检测结果。从感染患者脑脊液中检测到虫体是诊断此病的金标准，尽管此方法结果可靠，但是检出率很低，而且是侵袭性检查，因此难以普及，临床上也少见使用。实验室最常采用的诊断方法是ELISA法（检测患者血清特异性抗体），但用于ELISA法的抗原是虫体粗抗原，不但敏感性和特异性有待提高，也无法用于疗效考核。因此，寻找具有诊断价值的生物标记物对于改进和完善广州管圆线虫病的诊断方法具有重要意义。从已有的研究中不难发现，在寄生虫感染宿主过程中，宿主和寄生虫的组织蛋白酶均发挥重要作用。小鼠组织蛋白酶亚型众多，搜索Pubmed数据库可得到18种组织蛋白酶亚型，即是：CathepsinA,B,C,D,E,F,G,H,J,K,L,M,O,Q,R,S,W,Z。通过对有关宿主组织蛋白酶文献的分析，推测小鼠组织蛋白酶可能参与寄生虫感染所致脑炎的过程。从GenBank数据库中获得广州管圆线虫血红蛋白型半胱氨酸蛋白酶（Angiostrongylus cantonensis hemoglobinase-type cysteine proteinase GenBank号码：HQ110101.1）基因序列。研究发现虫源性组织蛋白酶与寄生虫的宿主入侵、自身保护和免疫逃避相关。本研究分两个部分：①感染BALB/c小鼠脑部组织蛋白酶各亚型的表达谱及变化规律研究；②广州管圆线虫血红蛋白型半胱氨酸蛋白酶基因的克隆。第一部分感染小鼠脑部组织蛋白酶各亚型的表达谱及其变化规律研究研究目的研究BALB/c小鼠Ac感染模型，动态观察感染BALB/c小鼠组织蛋白酶亚型的表达谱及表达谱的变化。为进一步寻找到可作为诊断广州管圆线虫病的生物标记物（biomarker）提供实验基础。研究内容和方法1.在GenBank中查找小鼠不同亚型组织蛋白酶家族基因序列信息。2.通过网站https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer，分别设计小鼠组织蛋白酶18个亚型（包括：cathepsinA,B,C,D,E,F,G,H,J,K,L,M,O,Q,R,S,W,Z）的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）引物。3.建立感染广州管圆线虫病的BALB/c小鼠动物模型，收集感染不同时点（7d、14d、21d）的脑组织，用Real-time PCR检测分析小鼠感染后各种亚型基因的表达情况。研究结果1.在GenBank数据库中共发现小鼠组织蛋白酶18个亚型，包括：cathepsinA,B,C,D,E,F,G,H,J,K,L,M,O,Q,R,S,W,Z。2.建立感染广州管圆线虫病BALB/c小鼠模型，通过对感染过程脑组织组织蛋白酶各亚型的表达水平的检测，发现不同亚型组织蛋白酶表达呈现三种变化趋势：逐步上升型（cathepsin C、E、S、Z）、陡然上升型（cathepsin G、K、L、M、Q、R）及不规则变化型（cathepsin J）。小结本次研究结果表明，感染广州管圆线虫病后，BALB/c小鼠的组织蛋白酶各亚型的表达水平发生变化，大多数组织蛋白酶亚型出现表达水平的升高。分析结果提示，小鼠组织蛋白酶S、C和M型具有进一步的研究意义。第二部分广州管圆线虫的血红蛋白型半胱氨酸蛋白酶基因的克隆研究目的对广州管圆线虫血红蛋白型半胱氨酸蛋白酶（AcHTCP）基因进行克隆和初步表达，为后续进一步研究此蛋白酶的免疫学功能做准备。研究内容和方法1.从GenBank中查找到AcHTCP序列信息，并对序列进行生物信息学分析。2.按常规方法，构建pET32a(+)/AcHTCP重组质粒，进行原核表达。研究结果成功构建pET32a(+)/AcHTCP重组质粒；成功建立AcHTCP原核表达体系，并进行初步原核表达。小结构建pET32a(+)/AcHTCP重组表达体系，为进一步的实验提供基础。