视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma, RB）是所有儿童实体肿瘤中最常见和最主要的眼内恶性肿瘤，其肿瘤发生率约为1:15000。对患儿的视力与生命都有严重威胁。肿瘤缺氧微环境在多数实体肿瘤中普遍存在，肿瘤细胞对缺氧的适应是肿瘤形成过程中一个关键的步骤。缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是由肿瘤内部缺氧所激活的一种转录因子，受多种癌基因、抑癌基因和生长因子的调节，并与肿瘤的发生发展、侵袭转移以及血管化形成等多种生物学特性有关。研究发现HIF-1在多种恶性实体肿瘤中呈现高表达并且与肿瘤的发生、发展与转移关系密切。鉴于HIF-1在肿瘤许多生物学行为中所起的关键性作用，近几年以HIF-1为基因靶点的抗肿瘤方案已经成为肿瘤治疗研究的热点之一。然而，HIF-1在RB中的表达及意义目前在国内外的研究文献中并不多见，其对RB的生物学行为的影响还有待进一步深入探讨与了解。本研究以肿瘤缺氧微环境理论为依据，通过RNA干扰技术沉默缺氧诱导因子HIF-1α基因表达，分别在体外与体内水平观察HIF-1α基因沉默对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞与裸鼠RB移植瘤致瘤性的影响，旨在为以缺氧诱导因子HIF-1α为靶点的RB抗肿瘤基因治疗提供理论基础与实验依据。第一部分缺氧诱导因子HIF-1α在人视网膜母细胞瘤中的表达及其意义目的了解缺氧诱导因子HIF-1α在人RB肿瘤组织中的表达情况以及HIF-1α表达与RB的病理分型和临床分期之间的关系；探讨缺氧对RB细胞株中HIF-1α基因的转录与蛋白表达水平的影响。方法1应用免疫组织化学方法检测32例人RB肿瘤组织标本与11例正常人视网膜组织标本中HIF-1α的表达情况。2利用SPSS16.0统计学软件，通过卡方检验分析HIF-1α表达与RB病理分型和临床分期之间的关系。3应用RT-PCR方法从转录水平分别检测人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1与HOX-Rb44细胞株中HIF-1αmRNA的表达情况。4应用Western blotting方法从蛋白表达水平分别检测人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1与HOX-Rb44细胞株中HIF-1α蛋白表达情况。结果1免疫组织化学检测显示，HIF-1α在人RB肿瘤组织中高表达，阳性表达率为84.38%；在正常人视网膜组织中低表达，阳性表达率为9.09%（P＜0.01）。2统计学分析显示，HIF-1α阳性表达率在分化型RB与未分化型RB肿瘤组织中差异无显著性（P＞0.05）；临床Ⅰ期RB组织中HIF-1α阳性表达率与临床Ⅱ期、Ⅲ期相比差异均具有显著性（P＜0.01）。3RT-PCR检测显示，在人RB细胞系WERI-Rb-1和HOX-Rb44两种细胞株中，无论在缺氧条件下或常氧条件下HIF-1αmRNA均呈阳性表达；两种RB细胞株中HIF-1αmRNA表达水平在低氧组与常氧组之间差异均无显著性（P＞0.05）。4Western blotting检测显示，在人RB细胞系WERI-Rb-1和HOX-Rb44两种细胞株中，常氧条件下HIF-1α蛋白均呈弱阳性表达，低氧条件下HIF-1α蛋白表达水平显著上调；两种RB细胞株中HIF-1α蛋白表达水平在低氧组与常氧组之间差异均具有显著性（P＜0.01）。结论1HIF-1α在人RB肿瘤组织中高表达，而在人正常视网膜组织中不表达或弱阳性表达；HIF-1α阳性表达率与人RB的病理学分型无关，而与RB的临床分期正相关。2缺氧主要在蛋白表达水平上明显增加RB细胞株中HIF-1α基因的表达，而缺氧对RB细胞株中HIF-1α基因的mRNA表达水平并无明显影响。第二部分针对HIF-1α基因的RNA干扰质粒的构建及其抑制效果检测目的构建特异性针对HIF-1α基因的RAN干扰质粒（HIF-1αsiRNA），并检测该重组质粒对RB细胞株WERI-Rb-1细胞中HIF-1α表达的抑制效果；为HIF-1α基因的功能研究提供理论基础与技术手段。方法1设计3条针对HIF-1α和1条阴性对照的寡核苷酸序列，并将其与酶切后的空白质粒连接，构建3条特异性针对HIF-1α的RNA干扰重组质粒与1条阴性RNA干扰重组质粒。2通过细胞转染的方法将重组质粒转染RB细胞系WERI-Rb-1细胞株，利用流式细胞术（FCM）检测各种转染试剂对该重组质粒的转染效果。3利用RT-PCR与Western blotting方法分别检测3条特异性针对HIF-1α的RNA干扰重组质粒对WERI-Rb-1细胞株中HIF-1αmRNA和蛋白表达的抑制效果。结果1成功构建了3条特异性针对HIF-1α的RNA干扰质粒pRNAT-HIF-1αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ与1条阴性RNA干扰质粒pRNAT-Neg siRNA；经基因测序检测证明，重组质粒DNA片段序列全部与Gene bank数据库提供的HIF-1α序列完全一致，无碱基缺失和错位。2FCM检测显示，经纳米高分子聚合物转染试剂EntransterTMR转染的重组质粒pRNAT-HIF-1α siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ与pRNAT-Neg siRNA的细胞转染效率分别为91.23%、90.54%、94.01%与89.76%，经脂质体LipofectamineTM2000转染的重组质粒的细胞转染效率为62.14%。 EntransterTMR转染各组和Lipofectamine转染组细胞的重组质粒转染效率分别与空白对照组相比各组间差异均有显著性（P＜0.01）；EntransterTMR转染各组与Lipofectamine转染组细胞的重组质粒转染效率差异均有显著性（P＜0.05）。3RT-PCR方法检测显示，三组分别转染了pRNAT-HIF-1αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ重组RNA干扰质粒的WERI-Rb-1细胞中HIF-1α mRNA表达水平明显下调，与对照组相比各组间差异具有显著性（P＜0.01）。其中pRNAT-HIF-1αsiRNAⅢ重组质粒的抑制效果最明显。4Western blotting方法检测显示，三组分别转染了pRNAT-HIF-αsiRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ重组RNA干扰质粒的WERI-Rb-1细胞中HIF-1α蛋白表达水平明显降低，与对照组相比各组间差异具有显著性（P＜0.01）。其中pRNAT-HIF-1αsiRNA Ⅲ重组质粒的抑制效果最明显。结论成功构建的特异性针对HIF-1α的RNA干扰重组质粒能有效地并特异性地抑制RB细胞系WERI-Rb-1细胞株中HIF-1α基因在mRNA与蛋白水平上的表达。为研究HIF-1α基因在视网膜母细胞瘤发生与发展中的作用提供了有用的工具。第三部分HIF-1α基因沉默对WERI-Rb-1细胞生长、凋亡以及HIF-1α下游基因表达的影响目的探讨质粒介导的HIF-1α基因沉默在体外水平对人RB细胞系WERI-Rb-1细胞的增殖、凋亡、细胞周期以及HIF-1α下游靶基因P53、P21、VEGF及bcl-2家族蛋白表达的影响。方法1MTT比色法检测HIF-1α基因沉默对WERI-Rb-1细胞体外增殖的影响2流式细胞术（AnnexinⅤ-PE与7-AAD双染色法）检测HIF-1α基因沉默对WERI-Rb-1细胞凋亡的影响。3流式细胞术检测HIF-1α基因沉默对WERI-Rb-1细胞周期的影响。4Western blotting检测HIF-1α基因沉默对WERI-Rb-1细胞中HIF-1α靶基因P53、P21、VEGF及bcl-2家族蛋白表达的影响结果1MTT检测结果显示，与同期对照组相比， HIF-1αsiRNA干扰组WERI-Rb-1细胞在缺氧条件下培养第1天未发现增殖抑制，第2天细胞增殖抑制率为8.24%（P＞0.05），第3天增殖抑制率为29.6%（P＜0.01），第4天增殖抑制率为49.1%（P＜0.01），第五天增殖抑制率为53.2%（P＜0.01）。2FCM检测显示，HIF-1αsiRNA干扰组与同期对照组相比，G1/G0期细胞数量增加，S期与G2/M期细胞数量减少，在细胞周期各阶段中两组的细胞数量差异均有显著性（P＜0.01）。3FCM检测结果显示，缺氧条件下培养48小时后，HIF-1a siRNA干扰组WERI-Rb-1细胞凋亡水平为48.97%，分别与同期空白对照组（17.53%）、转染试剂组（17.00%）以及阴性质粒干扰组（21.59%、）相比，各组间差异均有显著性（P＜0.01）。4Western blotting结果检测显示，与同期对照组相比，HIF-1αsiRNA干扰组WERI-Rb-1细胞中P53蛋白表达各组间差异均无显著性(P＞0.05)；bcl-2与p-p53蛋白表达轻度减少(P＜0.05）；P21与Bax蛋白表达显著性增加(P＜0.01）；VEGF蛋白表达显著下调(P＜0.01）。结论1HIF-1α基因沉默能抑制RB细胞系WERI-Rb-1细胞的体外增殖能力，使细胞周期停滞于G1/G0期，增加肿瘤细胞的凋亡。2HIF-1α基因沉默能以非P53依赖形式，通过下调bcl-2和上调Bax基因表达方式增加WERI-Rb-1细胞的凋亡；同时还可能通过下调VEGF基因表达方式减少其肿瘤血管化的形成并控制肿瘤生长。第四部分HIF-1α基因沉默对裸鼠RB移植瘤生长、凋亡及血管化形成的影响目的探讨HIF-1α基因沉默在体内水平对裸鼠RB移植瘤的生长凋亡以及血管化形成的影响方法1通过裸鼠皮下注射WERI-Rb-1细胞的方式建立裸鼠RB移植瘤动物模型；采用肿瘤瘤体内多点注射方式进行RNA干扰抑瘤实验。2抑瘤实验期间定期观察裸鼠RB移植瘤生长情况，用游标卡尺测量并计算各组裸鼠瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线；实验结束后处死裸鼠，剥离肿瘤组织并测量瘤体终重量，计算抑瘤率。3Western blotting方法检测RNA干扰沉默HIF-1α基因对裸鼠RB移植瘤中HIF-1α蛋白表达的抑制效果。4采用CD34单克隆抗体标记新生微血管内皮细胞的免疫组织化学方法检测裸鼠RB移植瘤组织中微血管密度（MVD）。5采用TUNEL法检测裸鼠RB移植瘤肿瘤细胞的凋亡情况。结果124只BALB/C(nu/nu)裸鼠右侧前肢腋窝皮下注射WERI-Rb-1细胞4周后，全部裸鼠皮下RB移植瘤均达到成瘤标准，且无一例死亡，肿瘤发生率为100%。2抑瘤实验后第6天开始，与同期对照组相比，HIF-1αsiRNA干扰组裸鼠RB移植瘤生长速度明显减慢（P＜0.01）。3与同期对照组相比，HIF-1αsiRNA干扰组裸鼠RB移植瘤终重量明显较轻（P＜0.01）。4Western blotting检测显示，与同期对照组相比，HIF-1αsiRNA干扰组裸鼠RB移植瘤中HIF-1α蛋白表达明显下调（P＜0.01）。5MVD法检测结果显示，与同期对照组相比，HIF-1αsiRNA干扰组裸鼠RB移植瘤组织中新生微血管的形成明显减少（P＜0.01）。6TUNEL法检测显示，与同期对照组相比，HIF-1αsiRNA干扰组裸鼠RB移植瘤肿瘤细胞的凋亡数量明显增加（P＜0.01）。结论HIF-1α基因沉默能通过减少裸鼠RB移植瘤新生微血管的形成，增加肿瘤细胞的凋亡的方式，抑制肿瘤的生长并降低其致瘤性。