造血干细胞移植是近30年来血液学重大进展的领域，作为一种治疗血液系统疾病、恶性肿瘤及部分遗传性疾病有效的方法，在临床上已得到广泛应用，取得了良好的效果。然而患者常常因造血功能迟迟不能恢复，发生严重感染或出血，最终导致移植失败，甚至死亡。自体移植是目前开展最广泛的一种干细胞移植形式，与异基因造血干细胞移植、自体外周血干细胞移植相比，自体骨髓移植后中性粒细胞，尤其是血小板的恢复需要较长时间。在骨髓损伤后的修复过程中、或造血干细胞移植后重建造血的各阶段，往往先有造血基质成分的恢复，而后才有造血的重建。移植前的预处理措施如大剂量放、化疗损伤了造血微环境的结构和功能，严重影响了移植后造血的重建过程。造血微环境的再生与重建是造血恢复的关键与先决条件。 机体体内正常的造血活动依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统，其中的细胞成分是该系统的关键。存在于成人骨髓中的间充质干细胞(MSC)是骨髓基质细胞系的前体细胞，是造血微环境中最重要的细胞成分，不仅是更新骨髓中基质细胞系的源泉，还同时分泌一系列造血生长因子促进造血干细胞的归巢、定居和增殖分化，在造血调控和造血重建机制中占有非常重要的地位。实验研究已经表明体外扩增的MSCs表达很多具有支持造血活性的生长因子，临床前和早期临床的安全性研究已经显示MSCs具有可移植性(长期植活、无移植毒性)、支持造血、促进植入、免疫调节等作用。间充质干细胞的体外扩增与联合移植将成为传统移植方式的有效补充和完善，值得进一步探讨。我们的研究旨在探讨人骨髓MSCs体内外支持造血的作用，为扩大进一步临床应用提供依据。 要利用骨髓MSCs就必须实现其体外的分离培养扩增。在第一部分工作中，我们用密度为1.073g／ml的Percoll细胞分离液密度梯度离心和早期贴壁分离相结合的方法获得了均一的人骨髓MSCs。研究其在体外培养中的生长曲线、贴壁率和分裂指数等细胞生物学特点。在原代培养过程中，MSCs呈集落生长，具有典型的纺锤状的形态，传代后则均匀生长。传代培养的人骨髓MSCs倍增时间为30小人骨筑间充质千细月包文持造.血的减开究中j忆摘委时，分裂指数最高达30%0，传代接种时间12小时90%以上的细胞已贴壁，反映了其旺盛的分裂增殖能力。人骨髓MSCs在低血清的培养条件下可以实现细胞的大量扩增。利用流式细胞仪(FCM)对体外培养的MSCs进行表型鉴定，选择较具代表性的指标:CD166、CD105、CD29、CD13及CD34、CD45和HLA一DR。结果发现CD166、CD105、CD29、CD13阳性率达99%以上。通过体外定向诱导的方法研究其多向分化的潜能，体外培养的人骨髓MSCS在特定的诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞分化。人骨髓MSCs液氮冻存1个月后复苏存活率约为90%，且在冻存时间分别为2个月、3个月时，重复测定其复苏存活率无明显差异。在本实验条件下进行MSCS体外连续培养的过程中发现:骨髓MSCs最多传代至30代，传至25代后生长速率逐渐减慢，部分细胞形态发生变化:传代至23代时，成功进行定向诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化。上述实验为深入研究MSCs对体内外造血的作用奠定了坚实的基础。 在第二部分工作中，我们应用长期骨髓细胞培养体系，分别通过MSCs培养上清促进集落形成实验、MSCs与CD34+细胞共培养实验初步探讨MSCs体外支持造血的作用。将脐血来源的CD34猎血细胞接种于经射线照射的MSCs单细胞层上，从而建立了长期骨髓细胞培养体系。在MSCs培养上清的刺激下，造血细胞在无血清的甲基纤维素半固体培养体系中形成了明显的造血集落，表明MSCs的培养上清具有促进造血集落形成的活性和能力。共培养5周后造血细胞仍具有体外集落形成能力，说明MSCs具有维系长期培养启动细胞的能力。MSCs与CD34+细胞共培养实验中，我们观察两个指标:悬浮造血细胞数量和造血细胞形成的集落形成细胞(CFC)数量。在悬浮造血细胞数量和造血细胞形成的CFC数量上，有MSCs培养组较无MSCs培养组均显著增多(P<0.01)。用3 pm的微孔滤过膜阻断MSCs与造血干祖细胞(HSPCs)的直接接触作用后，MSCs对造血干祖细胞的支持作用明显减弱。在悬浮造血细胞数量和造血细胞形成的CFC数量上，阻断接触共培养组较直接接触共培养组显著减少(P<0.01)。以上结果表明:璐Cs具有体外支持造血的作用;MSCS和HSPCs间的相互接触在MSCS支持造血过程中起着重要的作用。 在第三部分工作中，我们进行了MSCs支持体内造血的初步临床研究。建立了稳定的人骨髓MSCs体外大规模培养扩增体系和技术方法。培养扩增后的MSC具有纯度高，形态和表型均一的特点，通过FCM鉴定纯度可达99%，其扩增倍数护、劳垃间充质干细肥文扮造月血的布开究中文摘委超过16，000倍。对6例急性白血病自体骨髓移植病人进行了自体MSCs的同步联合移植。采集6例将行自体骨髓移植的急性白血病病人自体骨髓40~60ml，经14~34天(平均27天)的体外培养扩增后，收获并与骨髓同步联合回输数量为0.32~2.8 X 108(平均1.233 X 10，)的自体MSes，相当于每公斤受者体重0.