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棉铃虫Helicoverpa armigera是棉花、玉米、烟草、番茄等作物上的重要害虫。广泛分布于世界各地，在中国的棉花产区和蔬菜种植区均大量发生，对经济作物造成重大影响。棉铃虫属于全变态昆虫，发生量大，易人工饲养，现已成为鳞翅目昆虫研究的模式昆虫，且已进行了许多基础方面的研究。漆酶Ⅱ(laccase2，LAC2)是酚氧化酶的一种，是昆虫生长发育和变态方面重要的调节酶。全变态昆虫的生长发育，需要经过周期性的蜕皮，才能完成其变态发育过程。但是昆虫蜕皮后，新生表皮较柔软，抵抗力差，必须完成黑化和硬化过程，才能使虫体得到保护。LAC2主要通过“醌鞣化”作用促进昆虫表皮黑化和硬化。本试验以棉铃虫为研究对象，采用PCR、RACE等技术，成功克隆得到lac2基因的全序列；并采用实时荧光定量PCR技术，研究了lac2基因在棉铃虫不同虫态和不同发育阶段的时空表达；同时通过激素处理试验，明确了蜕皮激素和保幼激素类似物对lac2基因的调控作用；并通过RNA干扰蜕皮激素受体（ecdysone receptor，EcR；ultraspiracle，USP）试验，明确了蜕皮激素对lac2基因表达的调控作用；通过RNA干扰技术，探明lac2基因在表皮黑化中的作用；最终在原核大肠杆菌细胞中大量表达了棉铃虫LAC2蛋白；主要结果如下：（1）所得到的棉铃虫lac2基因cDNA序列全长为3221bp，命名为AF790460（GenBank登录号：KF479388），其开放阅读框长度为2268bp，编码756个氨基酸残基。预测信号肽位于1～14位氨基酸，预测分子质量大小为83.39KD，等电点为6.94，平均疏水性蛋白为0.917。Blast搜索结果发现棉铃虫LAC2与其他昆虫LAC2氨基酸序列具有较高的一致性，其中与家蚕Bombyx mori LAC2的一致性达95%，与烟草天蛾Manduca sexta LAC2的一致性达93%。通过SMART在线软件我们发现LAC2序列中含有3个Cu-oxidase结构域，其中第1个为Cu-oxidase-3，分布于200～310位氨基酸，长度为110；第2个为Cu-oxidase，分布于325～473位氨基酸，长度为148；第3个为Cu-oxidase-2，分布于577～737位氨基酸，长度为160个氨基酸。（2）对棉铃虫lac2基因的时空表达进行了系统研究，结果显示lac2基因在棉铃虫的不同发育阶段均有表达，但不同虫态间表达量有差异。一般随着棉铃虫幼虫的生长发育，lac2基因表达量逐渐增高，在每龄幼虫蜕皮期则高丰度表达，化蛹前达到最高，在蛹期表达量则相对较低。在幼虫的不同组织中lac2表达量有显著差异，表皮中的表达量最高，为其它部位的10倍左右，中肠和血细胞中表达量较低。成虫期虫体不同组织中lac2表达量也有明显差异，表皮、肌肉和脂肪体中的表达量相对较低，而在卵巢和触角中的表达量则相对较高（3）利用保幼激素类似物-Methoprene和蜕皮激素对5龄后48h幼虫进行体外注射处理，处理后在不同时间取样，通过荧光定量PCR结果显示，Methoprene可抑制lac2基因的表达。而以蜕皮激素处理后，结果显示蜕皮激素可促进lac2基因的表达。（4）利用体外合成蜕皮激素受体EcR（ecdysone receptor）和USP（ultraspiracle）双链RNA，注射入5龄后24h幼虫体内，结果发现蜕皮激素受体受到干扰后，ecr和usp基因的表达量显著下降。对蜕皮激素受体受到干扰的和未受到干扰的处理，分别注射蜕皮激素，结果发现蜕皮激素受体受到干扰后，lac2基因的表达量明显受到抑制，与未受到干扰的处理差异明显。这些结果进一步证明了，蜕皮激素对lac2基因具有促进其表达的调控作用。（5）选取5龄期生长良好，体色一致的初蜕皮棉铃虫幼虫，注射体外合成的lac2基因双链RNA，以GFP双链RNA处理作为对照。24h后利用超景深三维成像系统观察发现，注射lac2基因双链RNA的与GFP双链RNA对照组相比，幼虫体色黑化作用明显减弱。（6）实验室条件下成功构建了棉铃虫lac2基因部分片段融合表达载体，并将其导入大肠杆菌BL21（DE3）细胞，利用IPTG诱导表达技术和SDS-PAGE分析，正确表达出融合蛋白。