研究背景胶质瘤是颅内最为常见的恶性肿瘤。虽然现在对于胶质瘤的治疗包括手术、放疗、化疗等治疗,胶质瘤患者的预后仍然非常差。免疫治疗因能够直接作用于肿瘤细胞目前成为比较有前景的治疗新方法。这种方法能够维持长期的抗肿瘤免疫反应,同时没有任何神经系统副作用。氩氦冷冻治疗技术是近年源自美国氩氦冷冻治疗设备而兴起的一种低温冷冻技术。目前,此项治疗技术发展迅速,因为它操作简单,靶向性强,适应症广,加之治疗过程中靶区可以适时监测,对病人损伤小,消融效果确切。已经成为无法外科根治性切除的实体肿瘤患者治疗的最佳手段之一,极大的推动了临床肿瘤治疗学的进步,显著改善了肿瘤患者的治疗条件、生存状况和预后。随着近年来氩氦冷冻在全世界范围内的开展,它可对多种良恶性肿瘤施行精确冷冻治疗,尤其在肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾肿瘤、乳腺癌等治疗领域已广泛应用于临床。资料显示冷冻治疗效果不仅在于超低温直接杀伤肿瘤细胞,更重要的是激活机体抗肿瘤免疫系统。许多文献显示肿瘤通过氩氦刀治疗后能够有效的在体内传递抗原激活自身免疫系统。树突状细胞是最强的抗原呈递,它在诱导免疫方面起着至关重要的作用。目前在体外培养并通过肿瘤抗原致敏的成熟树突状细胞已作为肿瘤疫苗用于临床。但是,体内抗原刺激形成的成熟树突状细胞是最为便利的树突状细胞疫苗。在颅内胶质瘤治疗中,对于那些对化学治疗和放射治疗无效或不适宜手术治疗的病人,氩氦冷冻治疗为这些患者提供了一个有效的方法,但这一技术在颅内胶质瘤手术中的应用还不够成熟,临床上有少量的病例报道认为其对胶质瘤的疗效较好,但尚缺乏必要的基础研究和动物实验。本研究拟建立荷9L胶质瘤的F344大鼠动物模型,并进行氩氦冷冻治疗,观察肿瘤细胞病理以及树突状细胞的免疫变化情况,为其临床进一步应用提供理论依据。第一章9L/Fischer344大鼠脑胶质瘤模型及氩氦冷冻模型的建立及生存期观察目的1.成功建立胶质瘤大鼠模型。2.观察氩氦冷冻治疗荷脑胶质瘤鼠前后胶质瘤细胞形态学变化。3.空白对照组、手术切除组、氩氦冷冻组肿瘤生长情况及生存期观察。方法1.9L脑胶质瘤细胞的冻存和复苏；种植9L胶质瘤细胞于F344大鼠鼠背；荷脑胶质瘤F344大鼠模型的建立；胶质瘤标本制片,肿瘤组织病理学观察,GFAP和S-100蛋白免疫组织化学检测；动物模型的分组(空白对照组、手术切除组、氩氦冷冻治疗组)。2.各组胶质瘤大鼠的形态和病理学变化,观察荷脑胶质瘤大鼠；HE染色,电镜观察冷冻消融的肿瘤组织的形态;分别在干预治疗前、术后游标卡尺测量并计算、分析比较各组肿瘤的体积变化,以及各组大鼠生存期的观察。3.统计学分析：Kaplan-Meier生存分析描绘各组模型大鼠生存曲线；肿瘤体积的变化比较采用重复测量的方差分析。结果1.光镜下肿瘤细胞巢状排列紧密,肿瘤无包膜,瘤周小血管扩张,可见肿瘤细胞沿小血管浸润生长；瘤内新生血管丰富,瘤内常见出血、凝固性坏死灶。高倍镜下,肿瘤细胞形态多样,分化程度低,核大、多核,核质深染,异型性高。GFAP、S-100染色：肿瘤细胞未见染色,肿瘤细胞间胶质网可见阳性染色。2.氩氦冷冻组在冷冻后,HE染色示：冷冻中央区呈均匀性凝固性坏死。边缘区包括炎性反应带、出血水肿带(HEB)和边界带。炎性反应带主要为一些细胞碎片及大量的红、白细胞浸润；紧挨炎性反应带的是出血水肿带：微血管内也发现大量的红细胞、血小板集合和血栓形成,并可见灶性出血。电镜示：冷冻区中央、边缘区组织细胞全部坏死或凋亡。3.9L/Fischer344模型肿瘤持续生长；动物模型的分组(空白对照组、手术切除组、氩氦冷冻治疗组)的大鼠,平均生存时间分别为78.500±1.061、171.000±10.839、252.778±5.013天。各组模型大鼠平均生存时间经log rank检验,发现差异有统计学意义(X2=12.403,P=0.002)。4.接种后第30天空白对照组肿瘤体积达到5.197±0.162cm3,手术组达到5.002±0.175cm3,氩氦冷冻组5.024±0.159cm3,3组之间差异没有统计学意义(F=0.107,P=0.899)。干预后30天组间效应之间的差别有统计学意义(F=4648.049,P=0.000),各个测量时间点时肿瘤体积变化显示有统计学意义(F=1099.806,P=0.000),两者之间具有交互作用(F=1531.868,P=0.001)。结论1.9L/Fischer344大鼠胶质瘤模型成功建立。该方法建立的大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,大鼠脑内肿瘤持续生长,符合恶性胶质肉瘤生物学特性。模型成功率达100%。2.该方法简单、经济、直视下接种准确,种植肿瘤细胞30天,肿瘤体积便可达5-6cm3,背部便于消融。同时避免因为大鼠颅腔较小,消融后脑水肿造成动物死亡。因此,鼠背荷胶质瘤是氩氦冷冻治疗脑胶质瘤的理想动物模型。3.氩氦刀治疗后冷冻区中央区、边缘区的神经元细胞全部死亡,未发现存活的细胞结构,肿瘤逐渐消退,周围淋巴细胞浸润,其生存期显著延长,氩氦刀是治疗胶质瘤有效的方法。第二章氩氦冷冻治疗荷脑胶质瘤大鼠的树突状细胞的检测目的评定氩氦冷冻治疗组并与空白对照组、手术切除组比较荷脑胶质瘤大鼠的树突状细胞数目及成熟度的改变。方法1.9L脑胶质瘤细胞的冻存和复苏；种植9L胶质瘤细胞于F344大鼠鼠背；荷脑胶质瘤F344大鼠模型的建立；动物模型的分组(空白对照组、手术切除组、氩氦冷冻治疗组)。2.免疫组化检测干预后30天肿瘤组织内CD80+、CD83+、CD86+的表达情况并计数。3.免疫组化检测干预后30天脾脏组织内CD80+、CD83+、CD86+的表达情况并计数。4.流式细胞仪检测干预后30天引流淋巴结组织内CD80+、CD86+的阳性细胞的比例。5.酶联免疫吸附实验检测干预后30天外周血中IL-12、IFN-y细胞因子的变化。6.各组肿瘤、脾脏、淋巴组织、血清中指标比较采用重复测量的方差分析或单因素方差分析。结果1.免疫组化显示氩氦冷冻治疗组肿瘤及脾脏中CD80+、CD83+、CD86+细胞染色氩氦冷冻组较空白对照组及手术组显著密集(P<0.05)。2.流式细胞仪检测干预后30天引流淋巴结组织内CD80+、CD86+的阳性细胞的比例：氩氦冷冻组>手术切除组、空白对照组(P<0.05)。但是空白对照组和手术组之间没有显著差异(P>0.05)。3.酶联免疫吸附实验检测干预后30天外周血中IL-12、IFN-γ细胞因子的变化：外周血中IL-12：氩氦冷冻组>手术切除组、空白对照组,比较有显著差异(P<0.01),但手术切除组和空白对照组没有显著差异(P>0.05)；血清IFN-γ水平：氩氦冷冻组>手术切除组、空白对照组,比较有显著差异(P<0.01),但是空白对照组和手术切除组之间没有显著的差异(P>0.05)。结论运用免疫组化、流式细胞仪、酶联免疫吸附试验等多角度多手段测定各组大鼠树突状细胞的数量、成熟度及代谢产物的情况,表明氩氦冷冻技术能够促进树突状细胞成熟激发体内免疫。本实验为氩氦冷冻技术治疗脑胶质瘤乃至中枢神经系统肿瘤术后提高免疫提供重要的参考数据,为氩氦冷冻的临床应用奠定基础。