旋毛虫病是一种世界范围内广泛存在的人兽共患寄生虫病。人和动物主要通过食入含有旋毛虫幼虫的肉类与肉制品而感染,旋毛虫病给全球公共健康造成巨大威胁。旋毛虫的致病阶段主要是幼虫时期,肌幼虫被宿主食入后通过发育为肠道感染性幼虫（intestinal infective larvae,IIL）而侵入肠粘膜,经过4次蜕皮发育为成虫,雌雄虫交配产生的新生蚴随淋巴管和血液循环遍及全身,到达横纹肌的新生蚴又发育为肌幼虫。因此通过阻止旋毛虫幼虫侵入肠粘膜是研究的关键。目前的研究表明,旋毛虫侵入肠粘膜可能与其排泄分泌（ES）蛋白有关,本课题组前期从ES蛋白中鉴定出了一种旋毛虫丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis proteinase,Ts Serp）,该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族,而丝氨酸蛋白酶在寄生虫感染过程中具有降解宿主组织,协助寄生虫免疫逃避等功能。本研究克隆表达了Ts Serp（Gen Bank:AY028974.1）,对Ts Serp的生物学特性、抗原性及组织定位进行了鉴定,通过体外侵入实验、ADCC、抗rTsSerp血清抗体及细胞因子的测定,揭示了Ts Serp在旋毛虫侵入过程中的作用及Ts Serp所诱导的保护性免疫。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验用动物、佐剂、细胞类型该项研究所使用的旋毛虫虫种（ISS534）源于河南南阳家猪,由实验室传代保存。实验动物为来自河南省实验动物中心的雌性BALB/c小鼠以及昆明小鼠。佐剂为MONTANIDETM ISA 201 VG以及弗氏佐剂。实验用小鼠肠上皮细胞（IEC）为本实验室早期分离后传代保存的。2.旋毛虫丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析、表达及定位使用NCBI,SWISS-MODEL,signal P server-5.0等生物信息学在线软件对Ts Serp的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域等信息进行了预测和分析。将去除信号肽区域的Ts Serp基因克隆至p ET-32a表达载体（带有一个TRX-tag标签）中,构建重组表达质粒p ET-32a/Ts Serp,通过原核表达得到rTsSerp,将纯化过的rTsSerp通过皮下注射免疫小鼠,经过4次免疫获得免疫血清。利用Western blot技术对rTsSerp进行抗原性分析;分别应用RT-PCR、Western blot、免疫荧光试验（immunofluorescent test,IFT）,观察旋毛虫Ts Serp在旋毛虫不同期虫体的转录与表达水平及其在虫体组织的定位。3.rTsSerp在体外旋毛虫侵入IEC与肠黏膜过程中的作用将100条旋毛虫肌幼虫（ML）与胆汁孵育2 h激活为IIL,然后与不同浓度的rTsSerp或抗rTsSerp血清混合后加至IEC单层（或注射入离体的小肠段）,37℃培养2 h后,镜下观察侵入IEC与肠黏膜的幼虫数,评价rTsSerp及其抗血清在旋毛虫侵入粘膜过程中的作用。4.抗rTsSerp抗体介导的细胞毒性对新生蚴的杀伤作用（ADCC）将旋毛虫新生蚴与小鼠腹腔渗出细胞混合后加入96孔板,按照不同的组别加入不同稀释度的血清（1:10、1:50、1:100、1:200）,每个组别设置3个复孔。在37℃、5%CO₂条件下培养48 h,分别在0、12、24、48 h观察记录每孔新生幼虫存活情况。观察腹腔渗出细胞与旋毛虫新生幼虫的附着及新生幼虫的存活情况,判断抗rTsSerp血清介导的细胞毒性对新生幼虫的杀伤作用。5.rTsSerp免疫小鼠所诱导的体液与细胞免疫应答将200只小鼠分为4组（每组50只）,分别用rTsSerp、TRX-tag、ISA 201佐剂和PBS进行皮下注射免疫,共免疫4次,每次免疫间隔14天,收集每次免疫后不同组的小鼠血清,运用rTsSerp-ELISA检测各组小鼠血清中rTsSerp特异性Ig G、Ig G1、Ig G2a、Ig M及Ig E水平。同时,在末次免疫后2周收集小鼠脾脏及肠系膜淋巴结,经过研磨、洗涤、分离等方法收集脾细胞以及肠系膜淋巴结细胞,检测Th1（IFN-γ,IL-2）与Th2（IL-4）细胞因子的水平。6.rTsSerp免疫小鼠产生的免疫保护效果末次免疫后2周,应用300条旋毛虫肌幼虫对所有免疫小鼠经口攻击感染。感染后6 d与56 d分别剖杀10只小鼠,,观察肠道旋毛虫成虫数与肌幼虫虫荷,计算rTsSerp免疫组小鼠的的减虫率,评价rTsSerp的免疫保护效果。此外,观察不同免疫组小鼠感染后56 d咬肌的组织病理学变化。7.统计学处理使用分析软件SPSS 26.0对实验数据进行处理,数据的表述形式为平均数±标准差,主要运用卡方检验与方差分析,两组间的比较运用t检验,检验水准α<0.05。结果1.旋毛虫丝氨酸蛋白酶的生物信息学分析、表达水平及定位生物信息学软件分析结果显示,Ts Serp基因长度为1445 bp,编码421个氨基酸,p I为6.33。Ts Serp包含有一个胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶结构域,且氨基酸1-27号是该基因的信号肽区域。将扩增出来的Ts Serp基因克隆到p ET-32a表达载体中构建重组表达质粒p ET-32a/Ts Serp,并将其转染到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,将诱导出来的融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组菌表达的融合蛋白的分子量约为65.7 k Da。rTsSerp蛋白的分子量等于c DNA克隆（44.7 k Da）+载体的TRX-tag编码的蛋白（21 k Da）之和,且rTsSerp可带抗his标签的一抗及感染旋毛虫的小鼠血清所识别。RT-PCR与Western blotting结果表明,Ts Serp m RNA与蛋白在旋毛虫4个不同发育期均有表达,且Ts Serp在肌幼虫与肠道感染性幼虫期的蛋白表达水平显著高于成虫与新生幼虫期（χ²=62.405,P<0.001）;间接免疫荧光试验结果显示,Ts Serp主要定位于虫体表皮、杆状体与雌虫胚胎,提示Ts Serp是一种幼虫侵入蛋白。2.rTsSerp在体外旋毛虫侵入IEC与肠黏膜过程中的作用将rTsSerp蛋白及TRX-tag标签蛋白与100条IIL孵育后,加入IECs单层,2小时后观察侵入情况并计数。结果表明rTsSerp对幼虫侵入IECs作用具有rTsSerp剂量依赖性（r=0.996）,,而标签蛋白的浓度改变未影响侵入率,在Ts Serp及TRX-tag蛋白浓度为15μg/m L时,Ts Serp组和TRX-tag组的幼虫侵入率分别为86.96%和61.18%（P<0.01）,表明rTsSerp对幼虫侵入IEC具有促进作用。将不同稀释度的抗rTsSerp血清、感染旋毛虫小鼠血清及正常小鼠血清分别与IIL混合,然后分别接种到IEC单层中体外孵育2 h,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。结果表明,当血清稀释度为1:100时,抗rTsSerp血清、感染旋毛虫小鼠血清及正常小鼠血清组的幼虫侵入率分别为36.47%,27.13%及68.96%（P<0.01）,且抗rTsSerp抗体对幼虫侵入的抑制作用具有抗体剂量依赖性（r=0.986）,随血清稀释度的增加而降低（P<0.01）,表明抗rTsSerp抗体阻止幼虫对IEC的侵入。此外,将rTsSerp、TRX-tag、抗rTsSerp血清、抗TRX-tag血清或PBS处理后肌幼虫注入离体小肠孵育2 h后,幼虫对肠黏膜的侵入率分别为71.33%、45.67%、55.34%、57.6%及56.00%。表明rTsSerp明显促进了幼虫侵入（χ²=6.000,P<0.0001）,而抗rTsSerp血清显著抑制了幼虫对肠黏膜的侵入（χ²=4.900,P<0.0001）。3.抗rTsSerp血清介导的细胞毒性对新生蚴的杀伤作用（ADCC）当抗rTsSerp血清浓度为1:10、1:50、1:100、1:200时,ADCC介导的新生幼虫的死亡率分别为24.35%、24.47%、22.02%及17.68%,明显高于免疫前血清组的新生幼虫死亡率(t_1:10=3.959,P﹤0.05;:₅₀=4.562,P﹤0.01;:₁₀₀=8.981,P﹤0.01)。且对幼虫的杀伤作用随着血清浓度的升高而增强,具有抗体剂量依赖性（r=0.903,F=119.518,P﹤0.01）,这种杀伤作用也随着培养时间的延长而增加（r=0.921,F=18.356,P﹤0.01）。4.rTsSerp免疫引起的体液与细胞免疫应答BALB/c小鼠经过rTsSerp免疫4次后,血清特异性抗体（Ig G,Ig G1/Ig G2a,Ig E及Ig M）水平均随着免疫次数的增加而逐渐升高,而佐剂组与PBS组的抗体水平无明显变化。此外,Ig G1及Ig G2a抗体水平也明显增高,但Ig G1水平显著高于Ig G2a(t_4w=14.246 t_6w=22.291 t_8w=14.244)。表明rTsSerp主要诱导的是Th 2型为主的免疫应答。rTsSerp组与佐剂组及PBS组相比,Ig E与Ig M水平也明显升高（F=404.328,P<0.01）。细胞因子检测结果表明,在rTsSerp免疫后8周与攻击感染后2周,IFN-γ、IL-2及IL-4水平显著高于TRX-tag,佐剂及PBS对照组（P<0.0001）。结果表明,rTsSerp皮下免疫小鼠诱导了全身与肠黏膜局部的Th1/Th2混合型的Th1/Th2免疫应答。5.rTsSerp免疫小鼠所引起的免疫保护效果与PBS组相比较,免疫小鼠攻击感染后6 d与56 d,肠道成虫与肌幼虫的减虫率分别为47.36%（F=120.677,P<0.01）和54.85%（F=131.244,P<0.01）。病理切片HE染色结果显示,标签组、佐剂组及PBS组小鼠幼虫囊包周围有较明显的病理学变化,即幼虫囊包周围有大量的炎症细胞如嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润,而rTsSerp免疫组肌幼虫囊包周围的炎症细胞浸润明显减少（r=0.993,P<0.01）,提示而rTsSerp免疫可减轻旋毛虫感染后的肌肉炎症反应。结论1.构建了pET-32a/TsSerp重组表达质粒并表达纯化了rTsSerp,Ts Serp在旋毛虫的所有发育期均有转录及表达,但在肌幼虫与肠道感染性幼虫期的表达水平高于其他虫期,主要定位于虫体的表皮、杆状体。2.rTsSerp对旋毛虫侵入IEC与肠黏膜具有促进作用,抗rTsSerp抗体介导了ADCC对新生蚴的杀伤作用。3.rTsSerp免疫小鼠可诱导显著的体液与细胞免疫应答及明显的免疫保护效果。4.Ts Serp是一种旋毛虫侵入宿主肠黏膜的主要蛋白,可作为一种抗旋毛虫疫苗的候选靶抗原。