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纤维素类生物质原料在地球上存量丰富,将其转化为清洁能源(如生物乙醇)来替代不可再生的化石燃料意义重大。相比于传统上酶解和酸解的方法,热解法所产生的二次污染少,且可以更快速高效地将纤维素原料分解为以内醚糖为主的热解液,而内醚糖可以作为一种潜在的底物来实现大规模的乙醇发酵。本研究首先对热解液进行制备,然后在水解、萃取脱毒处理后进行摇瓶初步发酵和发酵罐扩大发酵,并构建数学模型对发酵行为进行模拟,随后再利用低能离子注入技术对受体酵母细胞进行刻蚀,初步探究低能离子注入对受体菌的影响并为介导内醚糖基因的遗传转化做准备。本研究获得结果如下: (1)热解过程中的真空度能影响内醚糖的产率。不彻底的真空环境会导致部分原料氧化燃烧,生成CO2和H2O等副产物,致使最后的热解液里内醚糖含量偏低。同样地,热解的温度同样会严重影响内醚糖产率。不同的温度下,热解液的成分含量会相差巨大。本实验制备的热解液中约含内醚糖146.35g/L,约为原料质量的12%左右。 (2)对热解液添加浓硫酸至H2SO4终浓度为0.2mol/L,并在0.1Mpa和120℃的条件下水解25min后,除了内醚糖被完全水解为葡萄糖外,热解液中存在的纤维二糖以及其它的一些低聚脱水糖类同时也被水解为葡萄糖,致使获得的葡萄糖浓度高于内醚糖理论上的转化量,约为理论产率的1.6倍。 (3)热解液的水解产物在经Ba(OH)2中和加吸附剂吸附处理后,其中残余的有毒化合物仍然能抑制Escherichia coli11177和Zymomonas mobilis11020的生长代谢。而先利用Ba(OH)2中和,再以与水解液体积比为2∶1的乙酸乙酯分三次萃取进行脱毒后,E.coli11177能有效发酵水解液为乙醇,但在相同的条件下,Z.mobilis11020却不能。说明相比于Z.mobilis11020,E.coli11177对有毒水解液环境的抗性更高、适应性更强。在摇瓶发酵中,其发酵所得乙醇产率约为0.40g乙醇/g葡萄糖,相当于理论产率的80%。 (1)发酵罐相比于三角瓶,可自动调控pH及溶氧等条件,因此大大地缩短了发酵时间,提高了乙醇发酵效率。E.coli的乙醇发酵产率可以达到0.40g乙醇/g葡萄糖,生产效率可达到约0.71g/Lh,其中生产效率远大于摇瓶中的效率,并且高于大部分文献报道的效率值。 (2)构建的数学动力学模型rx=0.19(1-X/3.8)X(也可以表示为t的函数,X=3.8e0.19t/2.8+e0.19t)符合Logistic模型,可准确描述菌体的生长,而分别描述基质消耗和底物生成的动力学模型rs=0.31 dX/dt+0.40X和rp=0.03 dX/dt+0.29X(也可以表示为S=S0-17.36(e0.19t-1)/2.8+e0.19t-8ln(2.8+e0.19t/3.8),P=1.68(e0.19t-1)/2.8+e0.19t+5.8ln(2.8+e0.19t/3.8))能很好的模拟实测值,且经过验证在一定浓度范围内都适用,将来有望指导中试生产。 (6)利用低能离子注入介导转基因技术对工业上发酵酒精的模式菌株Saccharomyces cerevisiae2.399进行低能N+离子刻蚀发现,在注入能量为15keV、注入剂量为10×1015 ions/cm2的条件下,S.cerevisiae2.399的细胞自我修复作用最强,存活率达到25%。 (7)对经过不同剂量离子注入并自我修复过的S.cerevisiae2.399进行乙醇发酵的摇瓶测试,结果发现,相比于原始亲本菌株,不同剂量的离子注入所产生的生物学效应不同,具体表现为乙醇发酵效率的差异和乙醇发酵关键酶(丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶)酶活性的差异,而这些差异是真空作用和离子注入的刻蚀作用共同作用的结果。在最适注入剂量条件下,S.cerevisiae2.399发酵葡萄糖的乙醇产率约为0.42g乙醇/g葡萄糖(达到理论产率的84%),与乙醇发酵相关的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶酶活值分别约为0.53和2.47(μmol·mL-1·min-1)。