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甘草酸(GL)是一类重要的糖苷类化合物,具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗高血压、抗高血脂及促进肾上腺皮激素等功效,同时作为食品添加剂和精细化工品被广泛的用于食品工业和化妆品领域。其衍生物单葡糖醛酸基甘草次酸(GAMG)具有更好的生物利用度、生物安全性、药用治疗价值,同时甜度更高、溶解性与吸收性更强,而且结构本身具有更丰富的活性官能团,可为设计新型的甘草酸衍生物提供新的思路。为了提高大肠杆菌表达真菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的底物特异性,本论文对催化水解甘草酸生成GAMG的PGUS-E进行一系列分子改造的研究,包括高效筛选PGUS-E底物特异性表达系统的构建,PGUS-E的非理性设计和半理性设计改造及其底物特异性机制的研究。同时,本论文探索了PGUS-E的特异性核酸适配体的筛选及其固定化应用研究。主要研究结果如下:以大肠杆菌E.coli DH5a为宿主,通过构建50nt的同源臂,利用Red同源重组敲除宿主自身表达得β-葡萄糖醛酸苷酶(E-GUS)的uidA基因。PCR验证和酶学考察成功敲除了uidA基因,消除了宿主β-葡萄糖醛酸苷酶(gusA)本底的干扰。构建了利用组成型表达真菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶,温度诱导表达噬菌体裂解酶SRRZ,一锅法(one-pot)筛选甘草酸催化底物特异性突变体的载体。考察了不同启动子强度的对PGUS-E表达的酶活影响,优化了不同温度下噬菌体裂解酶SRRZ的表达对宿主的裂解效率的影响。然后,通过定向进化技术对PGUS-E进行非理性改造。采用易错PCR构建PGUS-E的随机突变文库,通过优化Mn2+的浓度将突变率控制在1-2/kb,通过一锅法(one-pot)筛选方法进行筛选,通过筛选~10000个突变体后,获得了一系列底物特异性得到显著提高的突变酶,其中C9、F72和M51的效果明显,对甘草酸底物选择性分别提高了25%、37%和41%。结构分析表明突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置。利用Swiss-model同源建模构建了PGUS-E的三维结构模型,通过对突变位点的结构分析,TIM桶状结构域中α螺旋结构的变化对底物特异性的改善有很大的影响。为了进一步提高PGUS-E的底物特异性,对PGUS-E进行了进一步的半理性改造。利用同源比对确定了PGUS-E的活性位点,通过Autodock/Vina软件分子模拟对接了甘草酸、GAMG和葡糖醛酸与PGUS-E晶体结构的复合物结构,模拟预测得到的各底物结合位点并构建一系列的饱和突变体库。通过筛选~6000个突变体后,获得影响底物特异性关键位点Ala365和Arg563,底物特异性提高了65%和77%。将获得Ala365和Arg563位点进行组合突变,筛选甘草酸底物特异性进一步提高的突变体,其中突变体A365H/R563E、A365T/R563E的底物特异性分别为96%和95%。分析突变位点的结构变化,发现Thr365/His365的侧链通过范德华力的作用,π-π相互作用固定GAMG的部分糖基结构,减弱了GAMG与活性催化位点之间的亲和作用力,Glu563侧链的羧基影响Asp162的侧链使得五环三萜苷元的底物结合口袋更加紧密,进一步阻止苷元滑向Pgus-E的活性中心,提高PGUS-E底物的特异性,从分子水平解释了突变体氨基酸残基突变改变底物特异性的机理。建立了利用磁珠法SELEX技术筛选PGUS-E适配体的方法,构建了含有440个核酸随机文库,采用磁性纳米颗粒作为固相分离介质固定PGUS-E进行筛选核酸适配体。确定了dsDNA文库的PCR扩增的最佳退火温度、最佳扩增循环数,优化ssDNA的制备。经过18轮筛选,获得11个不同核酸适配体序列,通过序列分析,其二级结构主要以颈环和发夹结构存在。通过BIAcore亲和力测定和靶蛋白捕捉实验表明核酸适配体Apt5与PGUS-E有亲和力高、特异性强,其亲和力为200nM,达到了抗体-抗原的水平。考察Apt5固定化的PGUS-E的载体重复使用效率,使用7次后固定化的酶活为初始酶活的72%,Apt5的再生率为91%,具有良好的稳定性,为后续实现PGUS-E一步纯化固定化提供新的思路。