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本文对副溶血弧菌噬菌体(Vibrio parahaemolyticus phage)进行了固定化,制备出用于改善水体环境的噬菌体小球以及用于养殖动物口服的噬菌体微胶囊,为噬菌体固定化制剂的研制及应用奠定了基础。具体研究结果如下:1.采用复相乳液法,以乙基纤维素为包囊材料,明胶溶液为保护液制取微胶囊。检验了乙基纤维素溶液的浓度、搅拌速度、芯材:壁材的体积比以及保护液浓度对微胶囊制备的影响。通过单因素实验和正交实验,可以得到在实验条件下:搅拌速度均为600r/min,时间30min,芯材:壁材为1:3,壁材浓度为3%,明胶浓度为2%时得到的微胶囊综合评价最好。2.对噬菌体的吸附固定化实验结果如下:比较了4种吸附剂:滑石粉+硅藻土(3:1),活性炭,蒙脱石,玻璃纤维对副溶血弧菌噬菌体的吸附效果。其中,蒙脱石和玻璃纤维对噬菌体的吸附效果稍好,但由于吸附同样多的噬菌体,需要玻璃纤维的量(3g)远远大于蒙脱石(0.5g)的量,因而选择蒙脱石作为噬菌体的吸附剂。考虑了吸附剂的量、吸附时间及吸附液的PH对噬菌体固定化的影响。通过单因素实验和正交实验,可以得到在实验条件下:蒙脱石的量为0.5g,吸附时间为1h,吸附液的PH为6时,吸附效果最佳。3.保护剂海藻糖的制取及对噬菌体的保护作用实验结果如下:采用黑曲霉和酵母两步发酵木薯。测得黑曲霉在木薯培养液中在77—84h这段时间,发酵液中的还原糖的量达到最大,而在84h之前发酵液中总糖的量变化不大,之后随着进一步发酵,总糖的量逐渐减小。因而选在黑曲霉发酵木薯培养液80h左右时加入酵母。在相同条件的情况下,经黑曲霉发酵后的木薯培养液中所培养酵母菌数明显多于未发酵的木薯培养液,且不将黑曲霉离心直接加入酵母发酵的效果好于离心后再加入酵母发酵的效果。另外,随着发酵的进行氨基酸的量都有了显著的增加。800mL的酵母培养液经离心后得到39.013g的酵母,煮沸提取后,经过碱金属(重金属)除蛋白、活性炭脱色、阴阳离子交换、膜过滤、浓缩、结晶、过滤及干燥即得到成品,采用纸层析初步鉴定为海藻糖,经葸酮-硫酸法测得海藻糖的量为705.09mg,可知,从酵母中提取海藻糖的得率为1.807mg/g(湿重)。由海藻糖对副溶血弧菌噬菌体的保护作用实验可知,在常温条件下,海藻糖对副溶血弧菌噬菌体的保护作用不明显,有、无海藻糖保护的噬菌体的效价相差不大,都在106pfu/mL,当温度超过60℃时,对噬菌体的保护作用较为明显,有海藻糖保护的噬菌体的效价(1.6×106pfu/mL)比无海藻糖保护的噬菌体的效价(2.4×105pfu/mL)高了一个数量级。
由50℃水浴中作用不同时间的实验可知,作用10h以后,无海藻糖保护的噬菌体的效价(108)小于有海藻糖保护的噬菌体效价(109)一个数量级,说明海藻糖对副溶血弧菌噬菌体有较有效的保护作用。而在4℃时,无海藻糖保护的噬菌体效价从1.2×108pfu/mL降为2.5×107pfu/mL,下降了一个数量级,而有海藻糖保护的噬菌体的效价从2.6×109pfu/mL降为5.8×108pfu/mL,也下降了一个数量级,但较无海藻糖保护的噬菌体下降的幅度要小,酵母水提液中的噬菌体效价从7.3×108pfu/mL降为1.6×108pfu/mL,在同一数量级上,说明在4℃时海藻糖对副溶血弧菌噬菌体略有保护作用,其低温保护作用不如高温保护作用明显。4.以聚乙烯醇和海藻酸钠为载体材料对噬菌体进行包埋固定化得到大小为2—3mm左右的固定化小球。以此方法制得了三种小球:只加噬菌体的固定化小球I、蒙脱石先对噬菌体进行吸附固定再进行包埋固定的噬菌体小球II以及先在噬菌体中添加保护剂海藻糖,再蒙脱石吸附固定,然后包埋固定的噬菌体小球III。将这三种小球分别投入200mL灭菌的海水中作用15d后,比较三种固定化小球在水体中的作用情况可知,噬菌体小球I和II在水体中的噬菌体的量开始时是随着小球中噬菌体的不断释放而增大,但增大到7d后,其量开始减小,(噬菌体小球I从开始的3.5×105pfu/mL增大到4.2×106pfu/mL,7d后开始下降,15d时降到2.6×106pfu/mL,噬菌体小球II从开始的6.2×104pfu/mL增大到2.9×106pfu/mL,7d后开始下降,15d时降到2.3×106pfu/mL),而有海藻糖保护的噬菌体小球的水体中噬菌体的量仍然是不断增大(从1.7×106pfu/mL增大到2.5×106pfu/mL),说明噬菌体小球III中噬菌体的活性好于小球I和II。15d后,噬菌体小球II和III中噬菌体的量(分别为0.4×108pfu/mL和0.8×108pfu/mL)多于噬菌体小球I中的量(9.0×106pfu/mL),说明噬菌体小球II和III的包埋效果好于噬菌体小球I。由此可知,蒙脱石增强了吸附包埋的效果,而海藻糖对噬菌体的固定化制剂有着明显的保护作用。