生物粘合剂具有良好的生物相容性和可降解性,可以替代传统的缝合技术,在生物医药领域已被受到广泛关注。新月柄杆菌(Caulobacter crescentus CB15)能分泌迄今为止粘附能力最强的水下天然粘性物质-holdfast,其合成和分泌途径是一个复杂的过程,其中hfsH基因编码的多糖脱乙酰化酶是影响粘性的关键因素。因此,本论文以新月柄杆菌hfsH基因为研究对象,对其密码子进行优化及生物信息学分析,并进行了克隆和可溶性表达,在利用镍柱亲和层析分析纯化重组酶的基础上,对其生物学活性进行了初步评价。主要研究内容有以下几部分:第一部分:新月柄杆菌hfsH基因分析及载体构建。对hfsH基因的原始序列进行密码子优化,并利用RNAfold在线软件对优化前后hfsH基因序列的5′和3′端mRNA二级结构的自由能及GC含量进行分析。结果发现,优化后的序列自由能降低,GC含量从71%降至67%,更利于后期表达。生物信息学分析表明,有5个相对保守的氨基酸功能域分别是Motif 1(T(F/Y)DD)、Motif 2(H(S/T)xxH)、Motif 3(RxPY)、Motif 4(DxxD(W/Y)及Motif 5(I(V/I)LxHD),其相对分子量大小约29.2 kDa,等电点为6.26,为不含信号肽及跨膜区,二级结构主要以α-螺旋及不规则卷曲为主的亲水性不稳定蛋白。根据优化后的hfsH基因,分别设计Xba I和Xho I限制性酶的引物。以新月柄杆菌基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增,将PCR回收产物与pET-28a(+)载体连接,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定后,并进行测序验证。重组质粒命名为pET-28a(+)-hfsH,测序结果正确,表明重组质粒pET-28a(+)-hfsH已成功构建。第二部分:新月柄杆菌hfsH基因表达及重组酶纯化制备。将鉴定正确的重组质粒pET-28a(+)-hfsH转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析HfsH蛋白为可溶性蛋白。为了hfsH基因高效表达,对其表达条件进行优化,并确定最佳的表达条件:IPTG浓度为1 mmol/L,37℃诱导4 h。利用镍柱亲和层析方法进行纯化,其回收产率是4.65g/L,纯度达到85%。第三部分:测活方法的建立和重组酶HfsH的初步生物活性分析。因乙酰木聚糖酯酶与新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶属于同一家族,所以酶活测定选择乙酰木聚糖酯酶作为对照,以乙酸对硝基苯酯(PNPA)为底物,在415 nm处降解成对硝基苯酚,测定其新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶的比活性为61.8 U/mg,最适温度为35℃,最适pH为7.5。本论文为下一步新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶在结构功能的研究奠定了基础。