柑橘在世界范围内广泛种植,各种生物及非生物胁迫对柑橘生长发育产生不良影响从而降低果实品质和产量。由于其多胚、高度杂合、童期长以及自交不亲和等生物性状,使常规育种方法受到限制,而转基因技术由于其目的基因来源广、转化系统不受基因型控制、能够定向改良植物目的性状等优点而成为是目前柑橘育种最有效的工具。高效遗传转化体系是转基因技术应用的前提,虽已有研究者构建了有效的柑橘转化体系,但大部分柑橘种类或品种转基因效率依然很低,尤其是以成年态材料为外植体的遗传转化效率,因而柑橘遗传转化效率亟待提高。本研究以卡里佐枳橙和尤力克柠檬为材料研究了生长素极性运输与茎段上下端芽再生差异的联系及生长素在柑橘再生和遗传转化中的关键作用,并通过调控内源与外源的生长素浓度提高外植体的再生效率及转基因效率;同时以凤梨甜橙、哈姆林甜橙、埃及糖橙、伏令夏橙、卡里佐枳橙以及尤力克柠檬上胚轴节间茎段为外植体,研究利用KN1基因和IPT基因促进柑橘内源细胞分裂素的合成提高实生态柑橘遗传转化效率;另外,以成年态凤梨甜橙、伏令夏橙和华盛顿脐橙为研究材料,研究利用KN1和IPT基因提高成年态柑橘转基因效率,并通过生长素抑制剂以及甲基化抑制剂探索如何提高成年态柑橘再生效率,主要研究结论如下:1.生长素在柑橘再生与转化过程中的关键作用研究及其应用研究结果表明,内源生长素的极性运输导致外植体形态学下端的生长素浓度高于上端,从而抑制下端不定芽的再生。通过减少生长素对下端不定芽再生的抑制进而可提高不定芽的再生数量,且生长素极性运输抑制剂NPA本身具有增强细胞分裂素功能的作用进而提高不定芽的再生效率。结果显示NPA分别提高卡里佐枳橙和尤力克柠檬不定芽再生率2倍,经NPA处理后,枳橙平均每个外植体上可再生出6.6个芽,而柠檬每个外植体可再生出1.2个不定芽。另外,生长素能够显著提高农杆菌的侵染效率,在共培培养基中添加1 mg/L IAA,并在筛选培养基中添加20 mg/L NPA,转化效率提高3倍,最高可达82.2%。研究结果为今后的植物再生及转基因研究提供了部分理论与应用依据。2.过量表达KN1基因大幅提高柑橘转基因效率本研究探索了烟草花叶病毒35S启动子控制下的玉米KN1基因和SAUR启动子控制下IPT基因对柑橘基遗传转化效率的影响。研究结果表明,KN1基因提高了柑橘转化效率3至15倍,并且相对于这些柑橘基因型之前所报道的最高转化效率提高3至11倍。通过GUS活性组织化学染色和PCR分子检测证实T-DNA已稳定整合进柑橘基因组。且大多数KN1基因过表达的柑橘植物在生长发育正常。IPT基因提高转化效率4至9倍,相比于前人研究所报道的相同柑橘品种的最高转化效率提高2至11倍,但转IPT基因的柑橘外植体再生出大量丛生芽,无法发育成正常的植株。经过对所有6种柑橘基因型的转化效率,包括难以转化的尤力克柠檬的分析结果表明,KN1基因是一种高效提高多种柑橘品种遗传转化效率的分子工具。同样,柑橘的高效转基因技术体系以及利用基因组编辑技术进行品种改良是非常重要的。3.提高成年态柑橘再生及遗传转化效率的研究研究了玉米KN1基因和农杆菌IPT基因对柑橘成年态材料转化效率的影响,同时应用生长素极性运输抑制剂NPA及甲基化抑制剂5-Aza探索提高成年态柑橘再生的条件。研究结果表明,KN1和IPT基因可显著提高成年态柑橘转基因效率1.6至3.4倍,说明调控内源细胞分裂素浓度是一种有效提高成年态材料转化效率的方式。同时,甲基化抑制剂5-Aza处理外植体后,再生效率提高2至5倍。另外,NPA虽可以显著提高幼年态柑橘再生效率,当用NPA处理成年态外植体时其再生效率并未有显著变化。