第一部分腰椎黄韧带细胞的体外分离、培养、扩增及表型鉴定目的建立黄韧带细胞体外分离、培养、扩增及表型鉴定的方法,为后续黄韧带退变的病因学研究奠定基础。方法实验对象为2017年04月至2017年07在我院行手术的LSCS患者12例,年龄62.8±3.6岁;正常对照组12例,年龄57.9±8.5岁。所有受试者均需行后路减压手术,在病人知情同意和不影响手术疗效的情况下取黄韧带标本。用胶原酶预消化植块法分离培养黄韧带细胞,原代培养并传代。显微镜下观察黄韧带细胞从植块内迁出时间、细胞形态特征和生长状态;取P2代细胞,采用MTT法测定其吸光度（OD）值,评估细胞增殖情况;通过免疫荧光染色法进行黄韧带细胞的表型鉴定。结果体外培养第10天可见少量贴壁细胞,细胞呈多种形态,主要为梭形和多角形。培养第20天见细胞密集,已呈重叠生长,细胞形态趋向较均匀的短梭形。P2代细胞总数平均可达0.5×106个,从P0到P2代平均约需40天。两组同一代细胞在同一时间点的OD值差异无统计学意义（P>0.05）。P2代细胞经波形蛋白和I型胶原免疫荧光染色均呈阳性。结论1.胶原酶预消化后植块法黄韧带细胞培养能获得大量细胞,并能较好维持其生物学特征,是一种较为理想的人黄韧带细胞培养方法。2.两组患者在体外分离、培养、扩增LF细胞时所表现的生长及增殖特性一致。3.体外分离培养的黄韧带细胞呈显出成纤维细胞样表型。第二部分Leptin基因在腰椎黄韧带增生纤维化中的作用目的检测肥厚与正常腰椎黄韧带中Leptin m RNA及其蛋白表达的差异,探讨其在腰椎黄韧带增生纤维化中的作用,在此基础上体外进行黄韧带细胞培养,加入Leptin进行干预,检测干预后胶原蛋白表达变化,验证组织学结果并探索黄韧带增生纤维化的分子机制。方法本研究分两部分:组织学和细胞学实验。组织实验分两组:实验组（腰椎管狭窄症,LSCS）12例,正常对照组（腰椎间盘突出症,LDH）12例。所有受试者均需行后路减压手术,在病人知情同意和不影响手术疗效的情况下取黄韧带标本。术前采用MRI的Tl轴位加权像,经关节突平面精确测量两组黄韧带厚度;H&E染色评估黄韧带组织形态的改变,Masson’s trichrome染色评估黄韧带纤维化程度;免疫组织化学染色观察Leptin在黄韧带组织中的定位表达;荧光定量PCR及Western blotting检测两组黄韧带中Leptin的m RNA及蛋白表达的情况。体外行黄韧带细胞培养,分组加入不同浓度的人重组Leptin,检测I型胶原和III型胶原的表达变化。结果两组患者的一般资料无显著差异。LSCS组黄韧带厚度及纤维化评分明显高于对照组,且差异有统计学意义（P>0.05）。组织学研究发现肥厚黄韧带结构紊乱,成典型的纤维化改变,黄韧带厚度与纤维化评分呈明显的正相关。免疫组化分析显示LSCS组Leptin阳性细胞率明显高于对照组（p<0.05）,Leptin m RNA及蛋白在LSCS组中的表达均明显高于对照组（P<0.05）,且表达量与黄韧带厚度及纤维化评分呈正相关。细胞学研究发现人重组Leptin能明显促进黄韧带细胞I型和III型胶原的表达。结论1、肥厚的黄韧带呈现典型的纤维化改变。2、LSCS患者黄韧带Leptin表达增高,且表达量与黄韧带厚度及纤维化程度成正比。3、Leptin能促进LF细胞胶原纤维的表达,提示Leptin的异常表达可能是导致腰椎LF纤维化的一个重要病理机制。第三部分Lepin调控NF-κB信号通路在腰椎黄韧带增生纤维化的作用及机制目的探讨Lepin基因是否通过NF-κB信号通路调控腰椎黄韧带增生纤维化。方法在实验一和实验二的基础上,收集第二代黄韧带细胞,制备不同Lepin浓度细胞培养液,将黄韧带细胞分组培养48小时。采用RT-PCR、Westernblotting、ELISA等方法检测不同Lepin浓度组细胞中p65及IL-6 m RNA及蛋白的表达变化。在高浓度组Lepin培养液中加入NF-κB信号通路抑制剂Bay 11,采用RT-PCR、ELISA等方法检测IL-6 m RNA及蛋白的表达变化。结果Lepin能活化黄韧带细胞中的NF-κB信号通路;另外,Lepin能促进黄韧带细胞中IL-6的分泌;阻断NF-κB信号通路后能明显减弱Lepin诱导的IL-6的表达（P<0.05）;结论Lepin可通过激活NF-κB信号通路促进IL-6的表达,诱发局部炎症反应,这可能是导致黄韧带增生纤维化的重要机制。