论文部分内容阅读
顺铂和其它铂类抗肿瘤药物的成功应用促进了无机药物化学的发展，也激发了人们对其它过渡金属药物研究的兴趣。在大量的非铂类过渡金属化合物的研究中，钌基化合物以其生物利用度高、毒副作用小、抗肿瘤活性好得到人们的广泛关注。体内、体外实验均证实经静脉注射的铂基和钌基抗肿瘤化合物很大程度上都会与血清蛋白结合，尤其是血清白蛋白和转铁蛋白，这种结合在药物转运和代谢过程中起着重要作用。基于软电离技术的质谱分析，能够在分析检测过程中很好的保留金属抗肿瘤药物与蛋白质的共价（配位）结合，获得药物与蛋白质结合位点的信息;同时，质谱分析还具有灵敏度高，所需样品量少，耗时短以及适于分析复杂生物样品等优点，已成为研究金属抗肿瘤药物与蛋白质相互作用最强有力的工具。本论文的主要研究工作，是建立基于质谱的分析方法，研究钌、铂类抗肿瘤药物与蛋白质的共价相互作用，确认药物在蛋白上的结合位点，以及钌、铂类抗肿瘤药物与蛋白质的结合对其抗肿瘤活性的影响，为从分子水平上深入理解金属抗肿瘤药物在体内的转运过程和产生毒副作用的机理提供依据。主要的研究成果包括:
1.应用高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)研究了有机金属钌抗肿瘤药物[(η6-arene)Ru(en)Cl]+(arene=p-cymene(1) or biphenyl(2), en=ethylenediamine)、顺铂与含铁-或不含铁的转铁蛋白的相互作用，分别鉴定了三种化合物在转铁蛋白上的结合位点。钌化合物1、2都能与含铁或不含铁的转铁蛋白反应，与His242，His273，His578和His606残基共价结合;而顺铂与含铁或不含铁转铁蛋白的结合位点为Tyr136，Tyr317，Met256，His273和His578残基。除此之外，顺铂还能与不含铁的转铁蛋白C-端铁离子结合口袋底部的Thr457残基结合。
2.综合应用受体-配体识别分析，ICP-MS和体外细胞毒性测试方法，系统地研究了有机金属钌化合物1、2和顺铂与转铁蛋白的结合对药物细胞摄入和生物利用度的影响。研究结果表明，钌化合物1和2与含铁的转铁蛋白结合后，对其细胞摄入，生物利用度影响很小，钌-蛋白质复合物对人乳腺癌细胞MCF-7表现出与钌化合物本身相似的抑制活性。因此，应用含铁的转铁蛋白作为二价有机金属钌抗肿瘤化合物的靶向传输载体是可行的，并且可以克服由于胞内蛋白质不可逆结合导致的的抗药性。与此相反，尽管顺铂与含铁的转铁蛋白的共价结合也不影响转铁蛋白与其受体的相互识别和受体介导的胞吞，但是顺铂与蛋白共价结合后，不能在细胞内有效释放，导致顺铂抗肿瘤活性的急剧下降。
3.综合应用ICP-MS和体外细胞毒性分析方法，系统地研究了有机金属钌化合物1、2和顺铂与人重组血清白蛋白(rHA)的结合对药物细胞摄入和生物利用度的影响。人重组血清白蛋白分别于5倍量的化合物1、2和顺铂反应，平均1 molrHA结合0.95 mol的化合物1、1.03 mol的化合物2及3.38 mol的顺铂分子。与rHA的结合可以略微提高钌芳烃化合物1和2的细胞摄入，同时，rHA结合的(arene)Ru(en)在内体囊泡低pH条件下能够从蛋白上解离并传输至细胞核内与DNA结合。因此，与rHA结合的钌化合物1和2显示出与化合物自身相似的细胞毒性。与此相反，rHA结合的顺铂在中性和弱酸环境中很难从蛋白配体上解离，因此与rHA结合严重降低顺铂的生物利用度，表明顺铂经静脉注射进入血液后，与血清白蛋白的结合将会降低顺铂的细胞毒性，对血清白蛋白发挥正常生物功能也将造成一定程度上的影响。
4.结合胰蛋白酶酶切、液相色谱-质谱联用和串联质谱分析，研究了在有Cu+和无Cu+共存条件下钌化合物1、2及顺铂、反铂与铜伴侣蛋白Atoxl的相互作用，发现Cu+与Atoxl的结合能加快顺铂与Atoxl的反应，但对钌化合物与该蛋白的结合没有明显影响。串联质谱结果揭示无论是与apo-Atoxl，还是Cu+-Atoxl反应，受试的几种金属化合物都会与铜离子的配位位点结合。同时，两种反铂化合物与Atoxl的反应速率高于顺铂及两种有机金属钌化合物的反应速率。除此之外，与其它几种金属化合物相比，顺铂更容易促进蛋白二聚体的生成。