论文部分内容阅读
目的：核仁磷酸蛋白(nucleophosmin 1,NPM1)基因是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)最常见的突变基因,NPM1 A型突变体(NPM mutant A, NPM1 mA)约占75%-80%,对AML的发生发展,以及治疗有重要影响。然而,异位的NPM1突变蛋白对白血病细胞信号通路的调控机制尚未完全阐明。本文探讨白血病细胞中NPM1 mA与关键信号分子AKT的相互作用,以及NPM1 mA对AKT/FoxO3a信号通路的调控作用,进一步观察NPM1 mA介导的AKT活性对白血病细胞增殖与凋亡的影响。方法：免疫共沉淀实验观察NPM1 mA与AKT的相互作用；免疫荧光技术观察白血病细胞中NPM1 mA与AKT的共定位；Western blot检测NPM1 mA干扰和过表达后p-AKT以及下游分子FoxO3a的表达水平改变；不同浓度AKT抑制剂(AKT INHIBITOR Ⅳ, AKT Ⅳ)处理白血病细胞观察p-AKT蛋白水平的改变；CCK-8法和甲基纤维素克隆形成实验检测NPM1 mA介导的AKT活性对白血病细胞体外增殖能力的作用；流式细胞术和Hoechst 33258染色法观察NPM1 mA介导的AKT活性对白血病细胞凋亡的影响。结果：NPM1 mA能够与内源性的AKT蛋白相互结合并共同定位于OCI/AML3白血病细胞的胞浆部分。干扰OCI/AML3细胞中NPM1 mA的表达能够抑制p-AKT(S473)、p-AKT(T308)、 p-FoxO3a的表达,而总AKT和FoxO3a的表达没有明显改变。在HEK293T和K562细胞中过表达NPM1 mA能够上调p-AKT(S473)、 p-AKT(T308)、p-FoxO3a的表达。不同浓度AKT Ⅳ处理可使细胞p-AKT(S473)和p-AKT(T308)水平呈剂量依赖性降低,但不影响细胞总AKT的水平。CCK-8法检测发现,过表达NPM1 mA的K562突变组(K562 mA)较野生组(K562wt)和空载组(K562 c1)的体外增殖能力明显增强(P<0.001)、AKT Ⅳ处理48 h后,K562 mA组细胞仍然处于缓慢增殖状态,而K562wt组和K562 c1组细胞增殖明显受抑制。克隆形成实验发现,加入AKT Ⅳ培养2w后,K562mA组尚有克隆形成,克隆形成率为(1.2±0.4)%,而K562wt组和K562 c1组则未见克隆形成(P<0.001)。流式细胞术检测细胞凋亡发现,血清饥饿培养4h后,K562 mA组细胞凋亡率为(8.33±0.85)%,较K562wt组(15.01±2.24)%明显降低(P<0.05)。AKT IV处理后,K562 mA组细胞凋亡率为(42.95±3.35)%,较K562wt组(30.97±1.3)%明显增加(P<0.05)。此外,Hoechst 33258染色检测发现,K562 mA组较K562wt组和K562 c1凋亡细胞数减少；AKT Ⅳ处理后,K562 mA组凋亡细胞数明显增加,而K562wt组细胞处理前后凋亡情况没有显著差异。结论：白血病细胞中胞质NPM1 mA能够与AKT相互结合,通过调控AKT/FoxO3a信号通路影响白血病细胞的增殖与凋亡。