目的:人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS),也称艾滋病,严重影响人类健康。尽管现有的抗反转录病毒治疗(Antiretroviral Therapy,ART)能够抑制病毒的复制,显著降低HIV感染者外周血病毒载量水平,延缓疾病进展,延长感染者的生存时间,但都不能彻底治愈艾滋病。科学家们认为:只有修改或沉默已经整合在宿主基因组上的HIV基因,防止病毒复制,才能达到艾滋病的“功能性治愈”;只有清除整合在宿主上的HIV基因,才能彻底治愈艾滋病。而无论是彻底治愈或是功能治愈艾滋病都需要靶向结合HIV整合基因,在此基础上实现病毒基因的清除或编辑沉默,抑制病毒的复制,最终实现艾滋病的治愈。应用基因治疗以实现艾滋病的彻底治愈的HIV研究已经有二十多年的历史了,随着基因治疗技术的不断突破,也给艾滋病的治愈带来了新希望。目前有报到通过TALEN/Crispr等基因技术,编辑细胞表面受体CCR5基因,并将编辑的细胞回输体内,可以有效阻止HIV感染;也有通过RNA适配体的导入,阻断Tat蛋白与TAR RNA的结合,以此阻止HIV转录延长而达到抑制病毒复制目的的研究。但由于这些基因策略存在较强细胞毒性、也不是靶向整合的HIV病毒基因、靶向性较弱并且脱靶效应显著,理论上不能彻底治愈艾滋病,也不能应用于临床。科学家希望通过靶向编辑或清除HIV整合病毒基因组沉默转录,从而达到抑制病毒复制的目的,这是目前理论上能达到治愈艾滋病的唯一途径。因此,寻找特定靶向结合HIV整合基因的方法是HIV治疗的新目标。我们把目标锁定在诱导性胞嘧啶脱氨酶(Activation-induced Cytidine Deaminase,AID)。AID属于载脂蛋白B编辑催化多肽(APolipo-Protein B mRNA-editing Catalytic Polypeptide-like,APOBEC)家族成员,该家族成员均能与DNA或RNA结合,通过其胞嘧啶脱氨酶活性发挥编辑作用。APOBEC3G等多个家族成员都能使HIV病毒基因产生C-U-A突变,而呈现较强的抑制HIV病毒复制功能,但它们的抑制功能受制于病毒蛋白Vif。AID也是APOBEC家族成员,是否也具有突变HIV病毒而抑制病毒复制的作用,目前尚不明确。有报道称AID有抑制HBV病毒复制的功能,并能借助HBV病毒蛋白,定点靶向HBV的cccDNA。AID对HBV病毒复制的抑制作用依赖于RNA外切酶,能够结合HBV病毒蛋白P并定位在病毒pgRNA茎环结构,从而招募RNA外切酶降解病毒转录本,抑制HBV的复制。与此相似,HIV转录起始后也形成茎环结构转录活化应答原件(Transactivation-Responsive Element,TAR)RNA,Tat-P-TEFb结合后定位在TAR RNA处,促进HIV病毒转录延长。据此,AID是否也能识别HIV病毒TAR RNA的茎环结构,从而招募RNA外切酶,是否也具有抗病毒作用?我们希望通过研究,明确AID是否抑制HIV病毒复制,是否也能定向识别病毒基因,为抗HIV治疗提供有效的工具,为治愈艾滋病提供新思路。AID作为APOBEC家族成员之一,其是否具有抗HIV病毒复制的作用尚无报道。本研究以宿主蛋白AID作为研究对象,探讨AID是否识别、编辑HIV病毒基因组,并解析其作用机制。由于AID来源于宿主细胞本身,不影响细胞代谢和功能,更适合应用于治疗,因此我们还进行了AID是否能应用于抗HIV基因治疗的探索性研究,为突破艾滋病提供新方法。研究方法:1.实验对象1.1研究AID抑制病毒复制及具体机制:主要应用293T、TZM-bl等细胞系、人原代CD4~+T淋巴细胞。1.2研究AID抑制潜伏病毒的再激活作用:主要应用J-Lat6.3潜伏细胞系。J-Lat6.3潜伏细胞系是Jurkat T淋巴细胞系来源,插入单拷贝Env缺失、GFP代替Nef的HIV病毒。一般状态下,病毒不发生转录,当受到潜伏逆转剂刺激时,病毒转录并表达GFP报告基因。1.3 AID的临床应用性研究:32例HIV-1感染者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),包括未治疗感染者11例,短期治疗(治疗时间≤1年)者12例,长期治疗(1年<治疗时间≤6年)者9例。2.实验方法2.1细胞转染原代CD4~+T淋巴细胞电转质粒利用Lonza Amaxa Nucleofector试剂盒,4×10~6 PBMC转导2ug质粒,电转程序U-014。293T、TZM-bl细胞转导质粒或siRNAs利用Lipofectamine 2000或LipD293转染试剂,详细步骤参照试剂说明书。2.2荧光素酶及SEAP检测细胞裂解液的荧光素酶活性检测根据Promega公司相关试剂说明书。细胞培养上清液的SEAP活性检测根据Clontech公司相关试剂说明书。2.3实时定量PCR用QIAamp mini kit(QIAGEN)提取HBV DNA,用Trizol提取总RNA,DNase I去除DNA污染,EDTA失活DNase I。用Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)试剂盒进行RNA逆转录,SYBR Green进行实时定量PCR检测。2.4蛋白免疫印迹样品经RIPA裂解后,超声打断,离心收集上清液,加入4×SDS buffer煮沸变性。制作凝胶,80V电泳1h。4°C环境下过夜转膜(湿转),电压为30V。用2%BSA封闭1h;一抗孵育1h,PBST清洗3次,5min/次;二抗孵育0.5h,PBST清洗3次,5min/次;用ECL显影液显影1min后曝光。2.5蛋白免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)细胞经IP buffer裂解,裂解液冰上静置30min后离心,上清液转入新管中,沉淀进行超声打断,离心回收上清液。样本各留取100ul作为Input,其余样品与Dynabeads连接和抗体充分连接3h,之后样品用冷PBST清洗3次,回收beads。蛋白免疫印迹检测沉降下来的蛋白。2.6染色体免疫共沉淀实验(Chromosome Immunoprecipitation,ChIP)及Q-PCR检测细胞经IP buffer裂解,裂解液冰上静置30min后离心,上清液转入新管中,沉淀进行超声打断,离心回收上清液。样本各留取100ul作为Input,其余样品与Dynabeads和抗体连接,4°C条件下过夜,样品用冷PBST清洗5-7次。利用DNA小提试剂盒提取DNA混合物中的DNA片段,SYBR Green进行实时定量PCR检测。3.统计分析所有实验进行三次重复,用spss20.0进行描述统计及正态性分析。符合正态分布的数据,采用独立样本t检验或配对t检验进行分析,不符合正态分布的数据,采用非参数检验进行分析。P<0.05为组间差异有统计学意义。结果:1.AID抑制HIV-1病毒复制的研究1.1 293T细胞中,过表达AID显著降低NL43-luc的RNA表达水平和荧光素酶活性(所有p<0.01)。1.2人原代CD4~+T淋巴细胞中,过表达AID抑制野生型NL43的RNA表达水平和细胞培养上清p24蛋白的表达水平(所有p<0.01)。1.3 293T细胞体外感染模型中,AID显著结合病毒TAR区DNA(p=0.001)和Pol区DNA(p=0.001),并抑制RNA聚合酶II(RNA Polymerase II,RNAPII)结合病毒TAR和Pol(p=0.001,p=0.005)。1.4经测序发现,过表达AID与对照组的病毒序列点突变数量无明显差异。1.5敲减RNA外切酶不同组成蛋白(Rrp40、Mtr3),过表达AID组的病毒转录水平显著高于对照组(p=0.063,p=0.003);Rrp40蛋白结合AID,同时还结合HIV-1 RNA。2.AID抑制HIV-1病毒复制的机制研究2.1转导IV-04 ssDNA适配体(抑制TAR RNA),AID不能降低NL43-luc的RNA(p=0.371)表达水平和荧光素酶表达水平(p=0.719);转导IV-04mut和IV-60适配体(不能抑制TAR RNA),AID显著降低病毒Gag RNA(p=0.002,p<0.001)和荧光素酶表达水平(p=0.012,p<0.001),转导三种ssDNA适配体,AID能显著抑制HBV病毒RNA和DNA的表达(所有p<0.05)。2.2导入Tat抗体,过表达AID组HBV转录本水平显著低于对照组(p=0.01),而过表达AID组和对照组的NL43-luc荧光素酶表达水平无显著差异(p=0.561)。TZM-bl细胞中,过表达Tat时,AID组荧光素酶表达显著低于对照组(p=0.008),仅过表达AID不影响荧光素酶表达(p=0.459)。过表达Tat,AID显著富集TAR序列(p<0.001),但仅过表达AID不能显著富集TAR(p=0.342)。2.3过表达AID和NL43表达质粒,AID与Tat能互相结合,而Tat同时还结合RNAPII和CDK9(P-TEFb的组成部分),却不能结合A3G。2.4仅过表达AID,AID能结合Cyclin T1(P-TEFb的组成部分)。3.AID是否能用于抗HIV-1基因治疗的探索性研究3.1转导P19(AID突变体)显著抑制HIV-1感染者PBMC中HIV-1的转录水平(p<0.001)。3.2 J-Lat6.3细胞中,瞬时过表达P19显著抑制不同浓度TNF-α活化潜伏细胞的表达(一次实验结果)。3.3 J-Lat6.3细胞中,稳定过表达AID和P19显著抑制PHA、Prostratin和TNF-α活化潜伏病毒的表达(所有p<0.05)。结论:1.我们在国际上首次证明AID能抑制HIV-1复制,这种抑制作用不依赖其胞嘧啶脱氨酶活性。2.AID能够靶向结合整合的HIV-1病毒基因组,招募RNA外切酶利用3’到5’外切酶活性降解HIV-1转录本。3.AID借助病毒蛋白Tat定向结合于整合HIV-1基因的TARRNA区。AID结合P-TEFb不依赖HIV-1病毒蛋白的存在。4.P19是AID胞嘧啶脱氨酶缺失突变体,具有抗HIV-1的活性,有望成为HIV-1整合基因靶向编辑的有力工具。