前言:成人原发性中枢系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤为胶质瘤,按照WHO分级标准,胶质瘤可分为I-IV级,其中WHO IV级胶质瘤恶性程度最高。多形性胶质母细胞瘤作为WHO IV级胶质瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）在胶质瘤中发病率高,患者预后不良。按照最新的分子标志物GBM可分为三种亚型,即间充质型（MES）,经典型（CL）和前神经型（PN）。其中MES型恶性程度较其他亚型更高,患者预后更差,但是目前对于MES亚型肿瘤进展相关分子机制仍不十分清楚,亟待进一步研究。叉头盒（Forkhead box,FOX）转录因子家族是一个进化保守的基因家族,其家族成员在胚胎发育以及组织修复功能中发挥了重要作用。在FOX转录因子家族中有多个成员被发现参与了肿瘤的发生及发展过程的调控,其中FOXD1与前列腺癌、乳腺癌以及肾透明细胞癌等多种肿瘤的形成密切相关。我们在前期研究中发现FOXD1可以通过调控ALDH1A3的表达调节间质型胶质瘤干细胞（GSCs）的自我更新以及体内成瘤能力,且与GBM的进展相关。根据最新的研究报道和前期FOXD1可以调节糖酵解相关蛋白ALDH1A3的研究结果,在本研究中我们着眼于FOXD1在细胞水平上对胶质瘤细胞糖酵解代谢的影响,并对FOXD1调控其下游靶点AXL的相关机制进行了探讨。研究方法:（1）伦理审查:本研究由中国医科大学附属第一医院机构评审委员会批准。（2）GSCs培养:临床切除的标本分离成单细胞,在5%CO2,37°C条件下添加干细胞培养基培养原代神经球。（3）转染:质粒,慢病毒载体的FOXD1的对照和sh RNA用于敲低,慢病毒载体的AXL用于过表达,WB,PCR检测基因的敲低的程度。（4）免疫荧光:取胶质瘤细胞用抗FOXD1和AXL的抗体进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察并拍照。（5）蛋白免疫印迹分析:经提蛋白,蛋白定量,电泳,转膜,牛奶封闭,一抗,二抗,发光仪发光等步骤进行Western blot,FOXD1,AXL,β-actin,GAPDH抗体用于检测相应蛋白质表达;运用Image J软件进行定量。（6）q-PCR:使用TRIZOL法进行总RNA的提取,Hi ScriptⅡq RT Super Mix合成单链c DNA,然后用Cham Q Universal SYBR q PCR Master Mix进行q PCR检测。每个样品分3次重复运行,以β-actin作为内对照。2-ΔΔCt方法用于计算表达相对倍数。（7）荧光素酶活性分析:于Jaspar网站预测AXL启动子区域转录起始点上游的2000个碱基对的FOXD1结合位点。将具有结合位点为野生型和突变型序列和AXL启动子区域克隆到荧光素酶载体片段上。使用Promega双荧光素酶报告试剂盒检测转染质粒的荧光素酶活性。（8）乳酸生成实验:胶质瘤细胞消化成单细胞悬液,计数30万铺于六孔板上,24h后取培养基上清10ul,用乳酸生成检测试剂盒进行吸光度比较,换算成为乳酸浓度后比较差异。（9）Seahorse实验:胶质瘤细胞消化成单细胞悬液后每孔2万细胞铺于Seahorse专用96孔板上,24H后用seahorse XF 96机器按照方法检测ECAR值。（10）统计分析:所有实验至少重复三次,数据以平均值±标准差表示。组间比较采用卡方检验、t检验或方差分析。双尾P值＜0.05被认为具有统计学意义。使用Prism 7软件进行统计分析。结果:1、FOXD1在胶质瘤干细胞上表达高于正常星型胶质细胞IVY数据库分析FOX家族在胶质瘤样本中的偏好表达区域,用WB的方法验证已有的胶质瘤干细胞的FOXD1的表达情况并与NHA表达值对比。2、经慢病毒转染后FOXD1表达水平被显著降低。分别在GSC 40,GSC 4,U87上用sh RNA敲低了FOXD1的表达,通过荧光显微镜下观察GFP表达情况,验证转染效率,并进一步使用q PCR和WB的方法进行了验证。3、敲低FOXD1显著减少了胶质瘤细胞的乳酸生成和糖酵解能力乳酸生成实验和seahorse实验证明了FOXD1敲低后胶质瘤细胞的乳酸生成能力下降,糖酵解水平和糖酵解能力均有下降。4、FOXD1对下游AXL的表达调控验证及机制验证FOXD1敲低后经过PCR,WB验证AXL表达水平均有下调,荧光素酶实验证明FOXD1在转录水平上调节AXL的表达。5、AXL的过表达可使胶质瘤细胞的乳酸生成增加q PCR验证过表达FOXD1后AXL的表达上升,在敲低FOXD1的基础上对下游AXL过表达后胶质瘤的乳酸生成增加。结论:我们在证实FOXD1在原代胶质瘤干细胞上高表达,且通过调节下游的AXL的表达来影响胶质瘤细胞的糖酵解代谢,而下游AXL的过表达则可以增加胶质瘤细胞的乳酸生成