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鸭病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis, DVH)又称鸭肝炎,是由鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis virus, DHV)引起的一种急性、高度致死性的传染病,以肝炎为主要特征,主要发生于三周龄以下雏鸭。目前主要采用传统的弱毒疫苗和高免卵黄抗体进行Ⅰ型DHV的预防和治疗。然而,近几年来,国内许多地区频频出现免疫鸭群爆发鸭肝炎的报道,严重制约了养鸭业的发展。1.韩国新型DHV JFX-08株的分离及RT-PCR鉴定从山东省某疑似鸭肝炎发病区分离到1株病毒JFX08;血清中和试验结果表明该分离毒与传统的Ⅰ型鸭肝炎病毒无交叉保护;分离毒回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。根据已公布的韩国新型(基因C型)DHV的序列设计合成一对引物,进行RT-PCR扩增,结果得到大小约414bp的目的条带;测序分析发现,分离毒与传统Ⅰ型DHV之间的核苷酸序列相似性较低,而与韩国新型DHV之间的核苷酸序列相似性高达93.2%~94.0%;进化分析结果表明,该分离毒与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型DHV。2.新型DHV JFX-08分离株全基因组序列测序与分析根据已发表的DHV基因组序列设计多对特异的引物,按常规RT-PCR方法扩增毒株的中间相应区域,采用5’和3’cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法扩增病毒RNA的5’和3’末端序列。对分离株JFX08的全基因组进行了序列测定分析。结果表明,JFX08的基因组全长为7793nt,包括652nt的5’UTR、6753nt的ORF、366nt的3’UTR以及19nt的poly(A)尾巴。JFX08的ORF编码2251个氨基酸,各基因均与韩国新型的氨基酸序列相似性最高,与Ⅰ型DHV和台湾新型DHV的相似性均较低。其中VP1较Ⅰ型DHV存在2个氨基酸的插入和较多氨基酸位点的突变,高变区主要集中在180-194位和213-219位。JFX08的非编码区核苷酸序列之间存在大量碱基突变和插入/缺失。3.新型DHV VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHV VP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价可分别达1:25 600、1:51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。