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粪肠球菌是医院内和动物感染的重要病原体,对人、畜健康和食品安全构成严重的威胁。一般认为肠道表皮屏障是细菌性病原体侵入的优先入口,黏附并定植到肠上皮细胞是其感染的关键步骤。菌毛在革兰氏阴性和阳性细菌的感染中起着关键的作用,但动物源性粪肠球菌ebp菌毛基因的携带情况、保守性以及它的致病作用还不清楚。本研究通过对动物源性粪肠球菌的ebp基因分布情况、保守性进行分析,并原核表达ebp菌毛蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体,以分析其致病作用和免疫原性,从而为动物源性粪肠球菌感染的预防和治疗打下良好的基础。使用Nallapareddy等人所描述的引物,采用PCR方法对2006年至2011年间从河南省不同地区分离的50株动物源性粪肠球菌ebp基因的携带情况进行检测,结果显示50株动物源性粪肠球菌全部携带ebpABC基因。再根据GenBank上已发表的粪肠球菌OG1RF株的ebp基因序列,使用Primer Premier 5.0设计ebpABC全基因引物,对10株动物源性粪肠球菌ebp菌毛蛋白的编码基因进行PCR扩增,产物经胶回收试剂盒纯化回收,与pMD18-T载体连接,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆进行测序。然后应用DNASTAR(5.0版本)软件将测定出的10株动物源性粪肠球菌的ebp基因序列进行比对分析,并与粪肠球菌OG1RF株的ebp基因序列进行比较,结果显示测定的10株动物源性粪肠球菌之间ebpA、ebpB和ebpC基因DNA序列的同源性分别为98.0%-100%、98.8%-100%和99.0%-100%,所推导的氨基酸序列的同源性分别为98.4%-100%、98.2%-100%和98.7%-100%。10株菌与GenBank上已发表的人临床粪肠球菌OG1RF株相比,ebp基因DNA序列的同源性为98.2%-99.7%,所推导的氨基酸序列的同源性为98.5%-99.8%。由此可见,ebp基因在动物源性粪肠球菌中广泛分布且高度保守,并且与人源粪肠球菌的同源性也较高。使用生物信息学软件对粪肠球菌EbpA蛋白和EbpC蛋白的抗原表位进行预测,综合各软件的分析结果后将ebpA基因分成3段来表达,分别命名为ebpA1、ebpA2和ebpA3,将ebpC基因分成2段来表达,分别命名为ebpC1和ebpC2。然后,根据GenBank上已发表的粪肠球菌OG1RF株的ebpA和ebpC基因序列,设计5对带有合适酶切位点的引物,以提取的猪源粪肠球菌N9株的基因组DNA为模板分别扩增出ebpA1、ebpA2、ebpA3、ebpC1和ebpC2基因片段,大小分别为1167 bp、1098 bp、963 bp、981 bp和891 bp,扩增ebpB基因(EF1092A)所使用的引物引用Jouko Sillanpaa等人所描述的(酶切位点有改动),目的片段大小为1233 bp。将所扩增出的6个基因片段分别克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-28a-ebpA1、pET-28a-ebpA2、pET-28a-ebpA3、pET-28a-ebpC1、pET-28a-ebpC2和pET-28aEF1092A(ebpB),经测序验证6个重组质粒均构建成功。将重组质粒转化到表达菌大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG的诱导下均成功表达,获得了分子量大小分别约为46.7 kDa、45.0kDa、39.4 kDa、39.3 kDa、36.0 kDa和50.0 kDa的重组蛋白,与预期的目的蛋白分子量相符。通过优化表达条件,大量表达重组蛋白,用尿素法和镍柱对表达的蛋白进行纯化获得了高纯度的重组蛋白。使用6种已纯化的重组蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔,制备抗重组蛋白的多克隆抗体,经双向免疫琼脂扩散实验检测抗体效价分别为1:16、1:8、1:32、1:32、1:64和1:64。将多克隆抗体进行免疫印迹,结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合。而且,在多克隆抗体阻止野生菌株的生物膜生成实验中,当抗EbpA3蛋白IgG的终浓度为0.1875mg/mL时,粪肠球菌N9株的生物膜生成量最少,此数值与阴性对照值差异显著(P<0.05),表明抗EbpA3蛋白的IgG能够抑制粪肠球菌N9株生物膜的生成。