第一部分喉鳞癌与癌前病变中PCDGF基因mRNA和蛋白质表达及意义目的畸胎瘤源性生长因子(PCDGF)是新近发现的生长因子,在肿瘤发生发展中起重要作用。至今,尚无研究关于鳞状细胞癌,特别是喉癌的PCDGF表达状态。本研究的目的是探讨PCDGF与头颈鳞癌发生发展的关系,从而衡量PCDGF的临床价值。方法检测146例喉癌、108例成人乳头状瘤、41例喉粘膜白斑和10例正常喉部粘膜。利用实时定量PCR分析RNA表达水平;用免疫组织化学分析蛋白表达和定位。结果喉癌中PCDGF的RNA和蛋白质水平比正常粘膜的显著增高(P<0.001,P<0.001)。同时喉部癌前病变(乳头状瘤、粘膜白斑)中PCDGF的RNA和蛋白质水平比正常粘膜的也明显增高(P<0.05,P<0.05)。而喉部癌前病变(乳头状瘤、粘膜白斑)中PCDGF的RNA和蛋白质水平比喉癌的明显的低(P<0.05,P<0.05)。喉癌中PCDGF基因表达在各病理分级(χ2=3.84;P>0.05)和T分级(χ2=6.2,P>0.05)之间差异无显著性,而在是否有淋巴结转移(N0和N1)之间差异有显著性意义(χ2=7.93;P<0.05)。结论PCDGF是喉癌癌变过程中重要的自分泌生长因子。我们的发现也提示PCDGF可能成为喉癌早期诊断、靶向治疗和预后监测的合理标志物。第二部分PCDGF发卡状siRNA表达载体对Hep-2喉鳞癌细胞系PCDGF的表达和功能的影响目的RNAi是现代研究基因功能和发展治疗的有力的工具。本研究探讨siRNA诱导的PCDGF沉默成为喉癌的一种全新的辅助治疗手段的可能性。方法构建含2条shRNA的RNAi质粒,通过脂质体稳定转染PCDGF shRNA至喉鳞癌细胞系Hep-2,针对转染前后细胞通过绘制生长曲线测定生长增殖;软琼脂克隆形成实验分析非锚着依赖性生长能力;裸鼠移植瘤实验观察致瘤性;利用流式细胞仪Annexin-V-FITC和PI双标记法检测凋亡。结果s iRNAPCDGF转染的克隆的PCDGF的水平比对照组的明显低(73.7%)。siRNAPCDGF转染组细胞数在无血清培养基中比对照组少75.3%(P<0.001)。在含有10%FBS培养基中比对照组减少51.9%(P<0.001)。并表现出受损的软琼脂克隆形成能力(P<0.001),致瘤性显著减弱:40%成瘤率相对于对照组100%成瘤率;肿瘤重量要轻87%(0.46±0.6和2.2±0.5 g;P<0.01)。凋亡细胞比例从转染前的21.40%上升到71.72%(n=3;p<0.001)。结论PCDGF能正向调节喉癌细胞的增殖能力、非锚着依赖性克隆形成能力、裸鼠成瘤性和凋亡抵抗力。肿瘤要能发展,侵润转移的肿瘤细胞必须能逃避因脱离其黏附的正常底物而引发的凋亡并能在新的基质环境里保持高度的增殖活性。PCDGF很有可能参与喉癌致癌过程中这些独立而相互促进的事件。我们的工作使siRNA诱导的PCDGF沉默可能成为喉癌的一种全新的潜在的辅助治疗手段。第三部分喉组织原代培养系统的建立目的很多肿瘤研究是以建立的细胞系为基础进行的。然而细胞系是在体外培养压力下生长的一个克隆,并不代表整个细胞群体。现已证实,原发肿瘤的短期培养对评估复杂的试验结果更为可靠。建立一种有效便捷的喉癌培养体系,能同时收获肿瘤上皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞,能短时间收获足够多的活性高的细胞。更有利于肿瘤上皮与间质的相互关系和化疗药物和放疗的细胞特异性反应的研究。方法本实验在胶原酶法的基础上作适当的改良,克服微生物污染、细胞活性低生长缓慢、细胞不易纯化、传代困难。组织经原代和传代培养后,应用相差显微镜、HE染色、免疫组织化学和电镜来观察和鉴定原代分离培养的细胞。结果相差显微镜观察细胞活性好。上皮细胞成铺路石样;成纤维细胞成梭状密集。免疫组织化学染色显示上皮细胞角蛋白阳性;成纤维细胞波形蛋白阳性。投射电镜显示上皮细胞为恶性肿瘤细胞特征。结论本实验采用的原代培养方法有效、便捷和经济。可以获得活性好、纯度高的细胞,为头颈鳞癌的机制研究提供了较为理想的细胞模型。第四部分喉组织成纤维细胞中PCDGF基因mRNA和蛋白质表达及意义目的PCDGF是肿瘤发生发展中新近发现的生长因子。最近,越来越多的资料证明,在肿瘤发生中,肿瘤相关的基质并不仅仅是被动的反应者,更是主动的诱导者。至今,关于正常人类的成纤维细胞的PCDGF的表达尚无报道,且成纤维细胞分泌的PCDGF在致癌过程中的可能作用也不清楚。在此研究中,我们系统地检测来源于喉癌、癌旁无癌组织、正常喉组织和癌前病变(成人乳头状瘤)的成纤维细胞的PCDGF表达水平。方法分别收集10例喉癌、相应癌旁、成人乳头状瘤和正常喉部粘膜标本。利用实时定量PCR和Western-blot法测细胞表达的PCDGF。通过第三部分建立的原代培养方法,我们还检测了在体外持续培养的不同代数的成纤维细胞中的PCDGF的表达。结果在PCDGF的RNA表达和蛋白质分泌水平方面,CAF比癌旁成纤维细胞(P<0.01)、乳头状瘤成纤维细胞(P<0.05)和正常喉成纤维细胞都明显增高(P<0.001);乳头状瘤成纤维细胞比正常喉成纤维细胞也显著增高(P<0.05);而癌旁成纤维细胞与正常喉成纤维细胞却没有显著差异(P>0.05)。CAF和乳头状瘤成纤维细胞的PCDGF表达水平都明显增高。再者,第八代成纤维细胞的RNA和蛋白质表达水平比第三代的明显升高(P<0.01,p<0.01)。相反,在癌旁成纤维细胞与正常喉成纤维细胞,第八代成纤维细胞的RNA和蛋白质表达水平与第三代的相比无显著性差异(P>0.05)。我们应用免疫组织化学的方法也证实了PCDGF在喉癌和乳头状瘤基质中的表达。结论我们证明了CAF和乳头状瘤成纤维细胞以不依赖上皮的方式过表达PCDGF。且本研究还提示成纤维细胞的PCDGF参与了人喉鳞状细胞癌的发生发展。